マウス海馬スライス培養における単一細胞エレクトロポレーションによる遺伝子発現

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.スライス培養の準備

1. 後6〜7日齢の雌雄マウスを使用して、前述のようにマウス器官型海馬スライス培養物を調製します。
   1. 238スクロース、2.5 KCl、1 CaCl₂、4 MgCl₂、26 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄、および11グルコースからなる器官型スライス培養用の解剖培地を脱イオン水中で調製し、次に5%CO₂/95%O₂でpH7.4にガスします。
   2. 78.8%(v/v)ミニマルエッセンシャル培地イーグル、20%(v/v)馬血清、17.9 mM NaHCO₃、26.6 mMグルコース、2 M CaCl₂、2 M MgSO₄、30 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸(HEPES)、インスリン(1 μg/mL)、および0.06 mMアスコルビン酸、pHを7.3に調整した器官型スライス培地を調製します。浸透圧計を使用して浸透圧を310〜330浸透圧に調整します。
   3. 2本のヘラを使用して脳全体から海馬を解剖し、ティッシュチョッパーを使用してスライス(400μm)します。2本の鉗子を使用してスライスを分離し、インサートの下に培地(950 μL)を充填した6ウェルプレート内の30 mm細胞培養インサートに移します。
2. 器官型スライス培養物を組織培養インキュベーター(35°C、5%CO₂)に保管し、スライス培地を2日ごとに交換します。

2. プラスミドの調製

1. 目的の遺伝子のプラスミドを調製します.
   1. 増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子をpCAGベクターにサブクローニングします。
   2. エンドトキシンフリー精製キットでpCAG-EGFPプラスミドを精製し、140 mM K-メタンスルホン酸塩、0.2 mMエチレングリコール四酢酸(EGTA)、2 mM MgCl₂、および10 mM HEPESを含むピロカーボネートジエチル処理水からなる内部溶液に溶解し、KOH(プラスミド濃度:0.1 μg/μL)でpH 7.3に調整します。

3.ガラスピペットの準備

1. ウケイ酸ガラスピペット(4.5〜8MΩ)をマイクロピペットプーラーに引っ張ります(図1A)。
   注:全細胞パッチクランプ記録に使用されるガラスピペットは、エレクトロポレーションに最適です。
2. ガラスピペットを200°Cで一晩焼いて滅菌します。
解剖
3. 顕微鏡でピペットチップのサイズをチェックして、電気抵抗を概算します。
   1. オプション:ピペットをエレクトロポレーション電極に取り付けてピペット抵抗を確認し、マイクロマニピュレーターを使用して、119 NaCl、2.5 KCl、0.5 CaCl₂、5 MgCl₂、26 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄、11グルコースを含むフィルター滅菌人工脳脊髄液(aCSF)に操作します(mM単位):5%CO₂/95%O₂でpH7.4にガス化した脱イオン水中。エレクトロポレーターの読み出しを使用して実際の抵抗を確認します。
      注:ピペットチップが鋭いほど、電気抵抗は大きくなります。ピペットの抵抗は10MΩ未満である必要があります。ピペット抵抗が高いガラスピペット(図1B)は、エレクトロポレーションを繰り返すと先端で目詰まりすることがよくあります。

4. エレクトロポレーションリグのセットアップ

1. エレクトロポレーターを、シフトテーブルに取り付けられた正立顕微鏡、マイクロマニピュレーター、蠕動ポンプを備えた標準的な全細胞電気生理学リグに設置します。
2. エレクトロポレーターのヘッドステージをマイクロマニピュレーターに取り付け、スピーカーのペアをエレクトロポレーターに接続します。エレクトロポレーターをフットペダルに接続し、準備ができたらパルスを送信するために使用できます。
   注: スピーカーの電源を入れると、電極の電気抵抗を示すトーンが発せられます。これにより、手順から注意をそらすことなく、抵抗の相対的な変化を測定できます。

5. エレクトロポレーションの準備

1. スライス培養インサートを6ウェルプレートから3 cmのペトリ皿に移し、900 μLの培地をロードし、エレクトロポレーションを実行する準備ができるまで卓上CO₂インキュベーターに保管します。
   1. エレクトロポレーション後にスライスを培養するために、新鮮な培養インサートをスライス培地(1 mL)とともに3.5 cmのペトリ皿で少なくとも30分間プレインキュベートします。
2. リグを洗浄し、エレクトロポレーション用に準備します。
   1. その日の実験を開始する前に、ラインを10%漂白剤で5分間灌流し、チューブとチャンバーを滅菌します。
   2. ラインを脱イオンオートクレーブ水で少なくとも30分間灌流し、完全にすすぎます。
   3. 0.001 mMテトロドトキシン(TTX)を含むフィルター滅菌aCSFでラインを灌流します。
      注:TTXは、介在ニューロンの過剰興奮による細胞毒性と死を最小限に抑えます。
3. エレクトロポレーターのパルスパラメータを設定します:振幅5V、方形パルス、500msのトレイン、50Hzの周波数、500μsのパルス幅
。
4. ガラスピペットにプラスミド含有内部溶液5 μLを充填します。
   1. ピペットチップをフリックして軽くたたくと、ピペットチップに閉じ込められた気泡を取り除きます。
   2. チップを解剖顕微鏡で視覚化するか、ステップ3.3.1を繰り返してピペットの抵抗をチェックして、チップに損傷がないか確認します。
      注:チップが損傷している場合は、ガラスピペットを廃棄する必要があり、ステップ3で以前に準備した新しいガラスピペットでこのステップを繰り返す必要があります。
5. ピペットチップを電極にしっかりと取り付け、スピーカーの電源を入れます。チップがaCSF培地に接触したときのエレクトロポレーターの読み出し(ピペットの抵抗)を記録します。
6. 鋭利な刃を使用して培養インサート膜を切断し、培養物の1つのスライスを分離します。鋭角の鉗子を使用してスライス培養物をエレクトロポレーションチャンバーに慎重に移し、スライスアンカーでその位置を固定します。
   1. 神経細胞の健康状態や機能の変化などの副作用を防ぐために、スライス培養物をインキュベーターの外に一度に30分以上保管しないでください。

6. 目的のエレクトロポレート細胞

1. 口でピペットに陽圧を加えるか、チューブに取り付けられた1 mLシリンジ(0.2〜0.5 mL圧力)を使用してピペットに陽圧を加えます。
2. マイクロマニピュレーターの3次元ノブコントロールを使用して、スライス培養物の表面近くでピペットチップを操作します。
3. 標的細胞を選択し、顕微鏡下で見えるくぼみが細胞表面に形成されるまで陽圧を加えたままに近づきます。
4. 圧力サイクルを実行します。
   ピペット
   1. チップと原形質膜の間に緩いシールが形成され、膜がピペットチップにいくらか上がっていることで視覚的に示されるように、口から軽い負圧をすばやく適用します。スピーカーからのトーンの増加を聞いて、ピペット抵抗の増加(初期抵抗の~2.5倍)を観察します。ディンプルが再形成されるように、素早く正圧を再適用します。
   一
   2. 時停止せずに少なくともさらに2回の圧力サイクルを直ちに完了し、負圧を1秒間保持します。
      注:サイクルの間に一時停止したり、圧力をかけすぎたり、負圧を長時間保持したりすると、細胞に重大な損傷を与え、エレクトロポレーション中に細胞が死に至る可能性があります。
5. スピーカーからのトーンがピッチの安定した頂点に達し、ピーク電気抵抗を示したら、フットペダルを使用してエレクトロポレーターをすばやくパルスします。パルスを送信する前に、ピーク抵抗で1秒以上待たないでください。
   注:このプロトコルを使用した場合、オフターゲットエレクトロポレーションは観察されていません。圧力サイクル中にガラスピペットと接触した細胞のみをトランスフェクトしました。ピペットを他のニューロンの近くに配置しても、遺伝子トランスフェクションは行われません。
6. 圧力をかけずに、ピペットをセルから約100μmまでゆっくりと引き込みます。
7. 正圧を再適用し、抵抗がステップ5.5で記録された読み出しと類似していることを確認してから、次のセルに近づきます。
   >
   1. 正圧を加えることにより、エレクトロポレーション後にピペット抵抗が大幅に増加した(>15%高い)ことで視覚的に示される潜在的な詰まりを取り除きます。
      >注:目に見える詰まりがなく、抵抗がまだ大幅に高い場合は、ピペットを廃棄して新しいピペットを使用してください。平均して、ユーザーが注意すれば、ピペットは最大20回のエレクトロポレーションイベントに使用できます。
8. エレクトロポレーション後、スライス培養物を新鮮な培養インサートに移し、インキュベーターで35°Cで最大3日間インキュベートします。

図1:2つの代表的なガラスピペット画像。 (A)このプロトコルで使用される低抵抗(6.5MΩ)ピペットと、(B)エレクトロポレーションプロトコルに典型的な高抵抗(10.4MΩ)ピペットを表示します。