ラットモデルにおける脊髄修復のための自己組織化ペプチドと神経前駆細胞の注入

要約

出典: Zweckberger, K., et al.実験的頚髄損傷における神経前駆細胞と自己組織化ペプチドの相乗的利用 J. Vis. 経験。 (2015)。

このプロトコルは、ラットモデルにおける脊髄損傷修復のための標的注射アプローチを示しています。これには、自己組織化ペプチド (SAP) を病変コアに送達して支持足場を作成し、その後病変の周囲に神経前駆細胞 (NPC) を注射して組織を再構築することが含まれます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.子宮頸動脈瘤クリップ挫傷/圧迫モデル

1. 手術前に、器具をオートクレーブし、70%アルコール浴に入れることで、手術中ずっと無菌状態に保
ちます。
2. Wistarラット(250-270 g)を酸素(O₂)、亜酸化窒素(N₂O)(1:1)、および1.8-2.2%イソフルランの組み合わせで麻酔し、ガス麻酔マスクを介して自発呼吸をサポートします。麻酔導入には、5% イソフルランから 1 分間開始し、その後減らします。手術を開始する前に、痛みを伴う刺激(足など)を与えることで麻酔の深さをコントロールします。乾燥を避け、その後の感染症を防ぐために、脂肪分の多い軟膏を目に塗ります。
3. ラットを加熱クッション(37°C)に置き、頭を定位フレームに固定します。
4. 頸椎周囲の手術領域を剃り、ポビドンヨードと70%アルコールで消毒します。
5. 頸椎 (C2) から脊椎の上に正中線切開を行い、胸椎体 2 (T2) の顕起の突起に到達します。
6. 椎骨の筋肉の外層を正中線で直接切り裂き(出血を避けるため)、棘突起と椎板に到達するまで、さらに深い筋肉層を鈍く解剖します。リトラクターを挿入します。
7. 椎体T2の顕著な棘突起を方向付けて、椎弓切除術の目標レベルを観察します。選択した椎板の識別と顕微手術の準備の後、黄斑靭帯を切断して、椎弓板と棘突起を緩めます。最後に、脊髄の外側にある骨切りで椎板を切断し、脊髄自体の圧迫を避けて、それらを優しく取り除きます。
   注: 最も一般的なレベルは、C5/6、C6/7、または C7/T1 です。周術期死亡率は、損傷のレベルが吻側に向かうほど増加します。傍脊椎静脈洞からの出血は一般的であり、スポンジで注意深く圧迫することで対処できます。
8. クリップを挿入して臍帯に外傷を与える前に、クリッピングを防ぐために出現する神経根を特定します (特にレベル C5/6)。
9. スムーズなクリップ誘導を確実にするために、椎体の背側から腹側硬膜をフックで緩め、クリップ用の廊下を用意します。
10. 最後に、開いたクリップを挿入し、パチッと閉め(急速閉鎖)して挫傷を負わせます。クリップの閉鎖力とクリップの閉鎖時間によって、外傷の強度と圧迫の程度が決まります。一般的に使用されるのは、15〜35 gのクリップ力と、たとえば1分のクリッピング時間です(図1)。
11. クリップを取り外した後、筋肉を2層に適応させ、傷を閉じます。
12. 麻酔を中止し、胸骨横臥に十分な意識を取り戻すまで、継続的な観察の下で動物を目覚めさせます。最後に、ラットを単一のケージに入れ、術後の治療ガイドラインに従います。
13. 動物はこの種の損傷の重症度に苦しんでいるため、術後の治療に特別な注意を払う必要があります:
    1. 鎮痛剤(ブプレノルフィンとメロキシカムをそれぞれ3日間と5日間、臨床症状に応じて)投与します。
    2. 追加の生理食塩水を3日間皮下投与します(1日2回、5〜10ミリリットル(ml))。
    3. 手術の2日前から手術後7日まで、飲料水に抗生物質を投与します(例:モキシフロキサシン)膀胱
    4. 機能の回復が常に明らかになるまで、1日2〜3回膀胱を圧
    迫します。
    5. 少なくとも1日1回は、手術を受けた動物の神経障害と生理学的状態を観察します。

2. SAPおよびNPCの注射(損傷後14日)

1. 1.1〜1.3に記載のとおりに麻酔を誘発し、ラットの頭部を定位フレームに固定し、縫合または創傷クリップを取り外し、創傷および手術部位をポビドンヨードおよび70%アルコールで
消毒する。
2. 傍脊椎筋を注意深く解剖し、レトラクターを挿入し、硬膜から瘢痕組織を顕微鏡で除去し、病変部位を再露出させます。
3. SAPを1%(w / v)の濃度で調製して、細胞外マトリックスゲルを実行します。QL6 SAPは生理学的に適合するpHを持ち、注入前に緩衝する必要はありません。脊髄内のSAPの視覚化には、QL6の蛍光誘導体(QL6-フルオレセインイソチオシアネート[FITC])を使用します。
4. SAP(5マイクロリットル(μl))を病変の中心に注入し、正中線の両側にそれぞれ2.5μlずつ2つの部分に分配します。微小ガラスキャピラリー(外径[OD]100マイクロメートル(μm))で定位フレームに接続されたハミルトンシリンジを使用します。鋭利な針の先端で硬膜を慎重に開き、ガラス毛細血管を外傷した脊髄に2ミリメートル(mm)立体的に挿入します。
5. 容量の1/3を注入した後、針を1.5 mmの深さまで取り外し、さらに1/3〜1 mmの深さまで針を取り外します。全容量を注入した後、シリンジを取り外す前に、ゲル形成が安定するまで5分間待ちます。
6. NPCを生成するには、成体椎間板腫赤色蛍光タンパク質(DsRed)マウス(または黄色蛍光タンパク質[YFP]陽性マウス、緑色)を使用し、それらを脳室傍ゾーンから単離して培養します。
7. 細胞懸濁液中に~90%の生細胞が存在することを示すトリパンブルー染色によってNPCの生存率を評価します。増殖培地(50 x 10³生細胞/μl)で細胞を希釈し、細胞移植に使用します。
8. 損傷部位の吻側と尾側の2 mmに両側で2 μl(総容量8 μl、4 x 10⁵ NPCを含む)を4回脊髄内注射します。硬膜を開いた後、脊髄の背表面から1.5mm下にハミルトンマイクロガラス毛細管を挿入し、2μlの細胞懸濁液を注入します。約0.5μl/min(min)の注入速度を選択してください。
9. 各注射の終わりに、臍帯から毛細血管を取り除く前に、少なくとも1分間待ち、新しい細胞量に対応するために組織を伸ばします。(図2)

結果

図1:クリップ挫傷/圧迫動脈瘤モデル。(A) ラットのC7/T1椎弓切除術およびクリップ挫傷/圧迫後の手術顕微鏡による写真。 (B)正確な閉鎖力を保証するリングスプリングを備えたクリップの写真。

材料