マウスにおける睡眠から覚醒への移行のための神経回路の光遺伝学的操作

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物手術、ウイルス注射、EEG/EMG 用電極、光ファイバー移植

注意: 使用するウイルスのバイオセーフティ レベルに基づいて、適切な保護および取り扱い技術を選択する必要があります。アデノ随伴ウイルス (AAV) は、注射用の隔離された P1A グレードの部屋で使用する必要があり、AAV を運ぶチューブは、すべての容量を使い果たした後、オートクレーブで滅菌する必要があります。手術部位とすべての移植材料は、使用中は清潔で無菌でなければなりません。

メモ: 図 1 を参照してください。

1.オートクレーブで手術器具を消毒します。

2.麻酔気化器を使用してイソフルランでマウスを麻酔します。マウスが鉗子で尾をつまんだときの反応の喪失によって決定される所望の麻酔深さに達するまで観察します。目が乾燥するのを防ぐために、眼科用軟膏を目に塗ります。

3.ヨウ素溶液または70%エタノール(EtOH、3x)で手術野を消毒し、十分に乾燥させます。手術中にウイルスを氷の上で解凍させます。手術部位を吸収性のある実験台紙で覆います。

4.マウスの頭を、イヤーバーとノーズピンチで定位装置に固定します。頭が安定していることを確認した後、頭皮に正中矢状切開を行い、ブレグマとラムダの位置が水平線上の同じレベルにあることを確認します。

5.位置決めのギャップを避けるために、ノーズピンチとイヤーバーのレベルを上下に適切に調整します。ブレグマとラムダは、それぞれサツラサットルと冠状サチュラまたはスチュラランブドイダルの交差点を指します(図2)。

6. セラフィンクランプを使用して皮膚を保持し、頭蓋骨へのアクセスを維持します。頭蓋骨を露出させた後、頭蓋骨の表面をヨウ素または5%H₂O₂で消毒して、ブレグマとラムダを含む頭蓋縫合糸をより明確に視覚化できるようにします。

7. AAVベクトルインジェクションを準備します:

1。10 mLシリンジの内部( 材料表を参照)を70%EtOH、100%EtOH、滅菌水でそれぞれ5回順次洗浄します。シリンジをマイクロインジェクションポンプアームのクランプに固定し、シリンジ内のすべての溶液が排出されていることを確認します。

2. 気泡のない鉱物油2μLを慎重に吸引し、指定量のウイルス溶液を吸引します。吸引後、プランジャーボタンを操作し、針の先端にウイルス溶液が出てくることを確認します。

注:ウイルス溶液の注入量は、同じマウス系統および同じウイルス製品を使用したパイロット実験で決定されました。ウイルス溶液の量と感染領域の範囲との関係は、事前に推定する必要があります。

8. AAV vector:

1 を注入します。ブレグマのマイクロインジェクション針の先端を調整し、座標を元の点としてメモします。先端を指定された注射部位(BNSTの場合:前後+ 0.2 mm、内外側±1.0 mm、背腹側 - 4.2 mm)に移動し、針の先端をその位置に置きます。頭蓋骨に印を付け、0.7 mmの超硬カッターを備えた歯科用ドリルを使用して直径約2 mmの穴を開けます。硬膜や脳組織を傷つけないように注意してください。

2. 綿棒で穴の周りの血を取り除いた後、ゆっくりと針をBNSTの位置に動かします。機械式マイクロインジェクターで指定量のウイルス溶液(0.07 μl/min)をゆっくりと注入します。注射が完了したら、溶液がBNST組織に十分に浸透するまで、針を5分間放置します。慎重に針を外します。

3. 両側注入の場合は、反対側で手順 1.8.1-1.8.2 を繰り返します。手順全体を通して、頭蓋骨を湿らせておくために滅菌生理食塩水を塗布します。

注:4つのEEG電極(4 mm)、2つのEMG電極(2 mm、4 mm電極をニッパーで2 mmに切断)および6つの電極(4.5 mm)を備えたカスタム脳波(EEG)/筋電図(EMG)インプラント(幅:5 mm、深さ:7 mm、高さ:1 mm)を使用しました(図2A)。

9.2本のステンレス鋼線( 材料表を参照)をはんだ付けし、そこから1 mmの絶縁体を両端からEMG電極に剥がします。電極の中心を前骨に調整し、各 EEG 電極の位置 (前後 ± 1.5 mm、内外側 ± 1.0 mm) をマークし、インプラントの位置を決定します (図 2B)。

10. インプラント光ファイバー:

1.光ファイバーフェルールをマニピュレーターに取り付け、マニピュレーターアームを水平線に対して±30°の角度になるように回転させます(このプロセスは、BNST刺激の場合など、電極と光ファイバーの間の干渉を避けるためにのみ必要です)。ファイバーの先端をブレグマに置き、座標を記録します。

2. 先端をターゲットの挿入線に移動し、頭蓋骨上の位置をマークします。また、アンカーネジの挿入部位の近くに追加のマークを付けます。歯科用ドリルで各部位の頭蓋骨に穴を開けて光ファイバーを挿入し、ネジを固定します。頭蓋骨にネジを固定します。スクリューで硬膜を壊したり、組織を傷つけたりしないように注意してください。

3. マニピュレーターで BNST の上に到達するまで光ファイバーをそっと挿入します。フェルールは残りの頭蓋骨の上に置く必要があります(図1B)。

4. 光硬化性歯科用セメント ( 材料表を参照) を塗布して、繊維とネジを覆います。接着剤を固化させるための反応時間は、製造元のマニュアルで指定する必要があります(当社の材料は、特定の波長の光発生器を使用して少なくとも10秒間光にさらす必要があります。この後、接着剤を乾燥させる必要はありません)。

5. このステップでは、電極の取り付けスペースに材料 (ネジまたは接着剤) が占有していないことを確認します。さらに、光ファイバーとケーブルに接続するフェルールのセメントを中断しないようにしてください。両側刺激のために反対側で手順1.10.1〜1.10.4を繰り返します。

11. EEG/EMG電極用のドリル穴を開けます。電極の先端を穴に挿入します。インプラントを持ち、頭蓋骨と電極の間のスペースにシアノアクリレート接着剤を塗布します。材料に干渉しないように注意しながら再度挿入してください。

12.電極と光ファイバーの周囲をシアノアクリレート接着剤で覆い、続いて接着剤にシアノアクリレート促進剤を塗布します。このステップにより、フェルールから光ケーブル、電極からリード線への接続ゾーンでの中断が回避されます(図1C)。

注:シアノアクリレート接着剤とその促進剤はマウスの目に有害です。これらの化学物質がこぼれないように注意してください。また、接着剤固化直後の予期せぬズレを避けるため、電極や繊維に強く触れないように注意してください。

13.マウスの首の筋肉を露出させ、筋電図電極のワイヤーを筋肉の下に挿入します。EMG電極の長さを調整して、項筋のすぐ下に位置するようにします。電極の先端と筋膜の間の軽い接続は、EMG信号をキャッチするのに十分です。

14.シアノアクリレート接着剤を塗布してインプラントを充填し、加速液で接着剤を固化させます。次に、姿勢反射が現れるまでマウスを加熱パッドの上に置いて回復します。加熱パッドの温度を動物の安静時体温に調整します(C57BL6マウスの場合はZT 0-12で36.0°C、38.0°Cを超えないでください)。

注:無菌手術には抗生物質は必要ありません。術後鎮痛については、地域の施設のガイドラインに従ってください。マウスを家庭用ケージに保管し、少なくとも7日間の回復期間を

2. 特定の睡眠状態における標的ニューロンの光励起によるEEG/EMGモニタリング

注意: このプロトコルには、クラス 3B レーザー機器または LED デバイスの使用が含まれます。実験者は安全情報に注意する必要があります。保護メガネが必要です。

1. レーザー ケーブルを光ファイバーに接続する前に、スケーラーでレーザー強度を調整します。レーザーケーブルの先端をフェルールで未使用の光ファイバーにつなぎ、ファイバーとケーブルの接合部にスペースがないことを確認します。

2. レーザーのメインスイッチをオンにし、ウォームアップするまで 20 分間待ちます。

3. レーザーを強度チェッカーに放射し、レーザー強度を 10 mW/mm² に調整します。レーザーモードをトランジスタロジックに変更し、パターンレギュレータで制御するファイバから光パルスが放出され、持続時間は10ms、静止は40ms、サイクルは20回、リピートは20回(つまり、10msの光パルスを20Hzで20秒)に設定します。

4. 回復期間が終わったら、マウスを実験室に移動して脳波/筋電図を記録します。イエネズミは、食物と水を自由に利用できるように、12時間の明暗サイクルで一定の23°Cに保たれました。

5. 絡まりを防ぐために、スリップリングに繋がれている埋め込み電極とケーブルアダプターを接続します。レーザー漏れを防ぐために、接合部をアルミホイルなどの光不透過性の材料で覆うことをお勧めします。両側実験が必要な場合は、ケーブルに分岐アタッチメント付きのスリップリングを使用してください。

6. このプロトコルでは、非急速眼球運動 (NREM) 睡眠または急速眼球運動 (REM) 睡眠からの覚醒までの潜時を評価するため、記録時間は最適化されたツァイトゲーバー時間 (ZT0 はライトが点灯している時間として定義されます) に制限する必要があります。このプロトコルは、ZT4 から ZT10 の間で実施されました。マウスを順応として少なくとも1時間実験室内に自由に留まらせます。

7. 実験期間中、同じモニターで脳波信号と筋電図信号をモニターし、マウスの状態を覚醒、ノンレム睡眠、レム睡眠として評価します。各波のゲインコントロールを使用すると、各状態を区別しやすくなります。

8. NREM 睡眠から覚醒潜時までの測定には、40 秒間の安定した NREM 睡眠または 30 秒間の安定したレム睡眠を観察してから、光刺激用のパターン ジェネレーターのスイッチをオンにします (このプロトコルは、20 秒間 10 ms の光パルスを 20 Hz 生成します)。埋め込まれた光ファイバーへのレーザー放射を確認します。

9.睡眠状態が覚醒に変わるまで、EEG / EMG信号を記録します。2 つ以上の実験的試験が必要な場合は、光刺激は睡眠/覚醒の構造に影響を与える可能性のある人工的な介入であるため、光遺伝学的操作を 1 日 1 回に制限します。

10. 実験後、免疫組織化学的分析のために全脳をサンプリングするために、滅菌生理食塩水とパラホルムアルデヒド (PFA) を深く麻酔し、灌流します。

図1:AAVの注入、視線維の移植、およびEEG / EMGインプラントの手順。(A)ウイルス注入の実験手順。Creリコンビナーゼによって転写が活性化されるAAVベクターに組み込まれたEYFP融合ChR2またはEYFP(対照用)遺伝子をBNSTに両側注射しました。(B)電極との衝突を防ぐために、BNSTに向かって水平に対して30°の角度で光ファイバーを挿入しました。その周りに2本のネジが挿入されていました。(C) 光ファイバーを確実に配置した後、EEG/EMG 記録装置を埋め込みました。(D)手術の最後に、手術領域全体をシアノアクリレート接着剤で覆い、強力に固定する必要があります。電極とフェルールをつなぐ部分に薬剤を塗布しないように注意してください。

図2:カスタムEEG/EMG電極と電極ピン挿入部位。(A)上:6つの電極ピンのうち、外部の2つのピンは2mmにカットされています。下:EEG/EMG電極。 (B)次に、これらの電極とEMG導線をはんだ付けします。接続ゾーンは、シアノアクリレート接着剤などの断熱材で隔離する必要があります。電極の挿入部位は、ブレグマに対して相対的です(前後±1.5mm、内外側±1.0mm)。EMG ワイヤーは、挿入部位 (1 mm) でワイヤーを保護する絶縁体を除去して首の筋肉の下に挿入されます。