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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 刺激カフ電極の製造
- カフチューブを準備します.
- カミソリの刃を使用して、長さ2.5mmのポリマーチューブを切ります。鉗子の先端またはペーパークリップをチューブに挿入し、ブレードを使用してカフの片側のチューブの壁に縦方向にスリットを入れます。
- 鉗子をチューブから取り外し、長軸に垂直なカフの正中線に大きなミシン針を挿入します。針をスリット(上)から反対側のチューブの中心(下)に挿入します。針を発泡ボードに入れ、残りの組み立て手順でカフを所定の位置に固定します。
- 移植中にカフクロージャーを固定するために縫合糸を配置します。
- 小さなミシン針を袖口の壁を通して、片側の上部スリットから約 0.5 mm の正中線に挿入します。カフチューブの損傷を避けるために、針を内側から外側に挿入します。長さ 2 cm の 6/0 縫合糸を針の穴に挿入し、針をチューブの壁に通して縫合糸をカフに通します。
- 糸を所定の位置に残して、針を取り外し、カフの正中線に沿って、最初の穴の約0.5 mm下のチューブ壁に2番目の穴を開けます。針の目を通して縫合糸を挿入し、針をチューブ壁に通して、縫合糸を再びカフに通します。
- これで、縫合糸の両端がカフの外側にあるはずです。上の穴から~1.5 cm、下の穴から~0.5 mm伸びるように縫合糸を調整します。
- 下の穴から伸びる縫合糸の短い端に少量のUV(紫外線)硬化接着剤を塗布し、下尾がチューブの外壁とほぼ同じ高さになるまで長い縫合糸の端を引っ張ります。UVワンドを使用して接着剤を硬化させ、縫合糸を所定の位置にしっかりと保持します。
- カフの反対側で手順1.2.1から1.2.3を繰り返します。
- プラチナ:イリジウム(Pt:Ir)のリード線を配置します。
- 小さなミシン針を使って袖口の壁に4つの穴を開けます。各穴のペアは、垂直正中線から約0.5〜0.8 mmの位置に配置し、カフの両側の上部スリットから約0.5〜0.8 mmの穴を開ける必要があります。
注意: リード線を最も一貫して正確に配置するには、針を内側から外側に挿入してすべての穴を開けます。 縫合糸の配置をガイドとして使用します。 ミ- シン針を再度挿入し、今度はリード穴1から外側から内側に向かって作業します。長さ 7.5 cm の Pt:Ir ワイヤーの約 0.5 cm を針の穴に挿入し、針をチューブに通してリード線をカフ壁に通します。カフの外側に~4.5cm伸びるようにワイヤーを調整します(図1A)。
針- をリード穴 1 に再度挿入し、再び外側から内側に作業し、さらにリード穴 1 の真向かいにあるリード穴 2 に針を挿入します。Pt:Irワイヤーの短い方(内側)端の~0.5 cmを針の穴に挿入し、針をチューブに通してワイヤーリードをカフ壁に通します。
注: Pt:Irワイヤーの両端がカフの外側にある必要があり、スリットエッジの周りとリード穴1を通るワイヤーループが形成されます(図1B)。 - 手順 1.3.1 から 1.3.3 を繰り返して、Pt:Ir ワイヤをリード穴 3 と 4 に通します。
- ブタンライターを使用して、リード穴5とリード穴6から伸びるPt:Irワイヤーの端にある長さ2〜4.
注意:カフの損傷を避けるために、リードの端をカフアセンブリの残りの部分から慎重に分離します。怪我をしないように、工具を使用してワイヤーを保持してください。 - カフの内側の裸線を位置合わせして、リード線を最終的な位置に配置します。これを行うには、ワイヤの絶縁されていない部分が穴 1 と同じ高さになるまで、穴 1 から伸びる Pt:Ir ワイヤの端をそっと引っ張ります。もう一方のリード線で繰り返して、リード穴 3 と 4 に通されたワイヤの絶縁されていない端を揃えます。
カ- フの外側のリード穴1と3のワイヤーループに少量のUV硬化接着剤を塗布します。UV ワンドを使用して接着剤を硬化させ、リード線を所定の位置に固定します。
- 小さなピペットチップを使用して、絶縁されていないPt:Irワイヤーリードをカフの内壁に押し付けます。リード線を所定の位置に配置したら、リード穴 2 と 4 から伸びるワイヤーの端を切断して、約 1 mm のワイヤーがカフ壁の外側から伸び
るようにします。- ワイヤーの1mmテールをカフの外面に対して平らに折り、短くならないように注意します。少量のUV硬化型接着剤を塗布して2つのテールを覆い、接着剤を硬化させてリードの配置を固定し、電気絶縁を提供します。
注意:外部から露出したPt:Ir表面を接着剤で完全に覆い、ワイヤーを絶縁し、ターゲットから外れた刺激を避けることが重要です。
- Pt:Ir ワイヤー リード線を縫合糸固定で所定の位置に固定します。
カ- フアセンブリ付きの大きな針をフォームボードから取り外します。針の目を通して長さ3cmの6/0縫合糸を挿入し、針をチューブに通して、縫合糸をカフの底の中間点に通します。
- 小さなミシン針に切り替えて、Pt:Ir リード固定のための縫合糸通しを完了します。同じ正中線の穴に針を挿入し、チューブとリード線の変形を避けるために内側から外側に再度作業します。縫合糸の外側の尾部を針の穴を通して挿入し、針をカフの壁を通して引っ張って、カフの端の周りに縫合糸のループを作成します(図1C)。
注:鉗子を使用し、顕微鏡下で作業して、縫合糸がカフの長軸に沿って向き、チューブに対して平らであることを確認します。このステップにより、リードがカフの内側で分離されたままになり、カフの正中線の外側に所定の位置に保持されます。 カ- フの外側で縫合糸の端を半結びに結び、カフの反対側の端に2番目のループを作成します。縫合糸がカフの長軸に沿って走り、チューブに対して平らになるようにします。結び目をチューブに平らに当てるようにしっかりと保持しながら、ハーフノットに少量のUV硬化接着剤を塗布し、所定の位置に保持するように硬化させます。
- 縫合糸の端を結び目にできるだけ近づけて慎重にカットします。必要に応じて、少量の追加UV硬化接着剤を使用して縫合糸の短端を接着し、チューブに対して平らに置くようにします(図1D)。
- コネクタピンをPt:Ir線リード線にはんだ付けします。
- ブタンライターを使用して、各 Pt:Ir リード線の端にある ~3 mm から絶縁体を剥がします。金ピンのカップ側( 材料表を参照)を各リード線の絶縁されていない端にはんだ付けします。
- 組み立てられたデバイスのインピーダンスをテストします。
- LCR(インダクタンス(L)、静電容量(C)、抵抗(R))メーターまたは電極インピーダンスチェックモジュールの入力に金ピンを接続し、テスト周波数を1kHzに設定します。カフチューブ(およびカフの内部にあるPt:Ir刺激接点)を生理食塩水で満たされた小さなビーカーに沈め、金のリードピンとプローブコネクタを乾いた状態に保つように注意します。移植を続行する前に、組み立てられたカフの1kHzでのインピーダンスが2kΩ未満であることを確認してください。
注:インピーダンスが高いということは、多くの場合、露出したPt:Ir表面積が不十分であることを示しており、これは、絶縁体の不十分な除去、カフ内部への接着剤の偶発的な塗布、断線などの要因によって発生する可能性があります。 等。また、カフに、長期間使用すると接点が短くなる可能性のある断線や不十分な配置がないか検査する必要があります。
2. ヘッドキャップの構造
注
: ヘッドキャップの組み立て手順は以前に公開されたものと同様であり、便宜上ここに要約されています。
- ヘッドキャップを組み立てます
長さ - ~13 mm の 30 AWG (American Wire Gauge) ワイヤ ラップの 2 つの小さな部分を 1 ~ 13 mm と長さ ~10 mm の 1 つをカットします。両方のワイヤの両端から~1.5mmの絶縁体を剥がします。金ピンのピン側を各ワイヤの一端、できるだけカップに近づけてはんだ付けします。ワイヤーカッターを使用して、はんだ接合部を超えた余分な長さのピンを切り取ります。
- AWGワイヤのもう一方の端を、4ピンマイクロストリップコネクタの2つの中央のはんだカップにはんだ
付けします。- 図2Aに示すように、ワイヤーヘッドキャップのリード線をコネクタに向かって曲げ、金のピンをコネクタに対して平らに平らに置きます。短い方のワイヤに接続されているピンは、長い方のワイヤに接続されているピンの下に配置する必要があります。ネイルアクリル、歯科用セメント、またはUV硬化接着剤を使用して、ヘッドキャップのリードを所定の位置に固定します。
3. デバイスの使用
- 慢性迷走神経刺激のためにカフ電極を埋め込みます。
注: すべての外科的処置は、NIH (国立衛生研究所) 実験動物のケアと使用に関するガイドラインに従い、地元の IACUC (施設動物ケアおよび使用委員会) の承認を得て、適切な麻酔下で無菌または無菌技術を使用して実行する必要があります。次の手順は、デバイスの代表的な使用法を説明するためのものであり、包括的なものではありません。- ラットを定位固定フレームに入れ、頭頂骨と後頭骨を矢状切開して頭蓋骨の表面を明らかにし、ヘッドキャップ/コネクタを移植します。頭蓋骨に慎重に 4 つの穴を開け、宝石商のネジを置きます。歯科用アクリルを使用して、ヘッドキャップを頭蓋骨とネジに固定します。
- ネズミを定位固定フレームから取り外し、右側に置きます。首の左側の皮膚に垂直切開を行い、胸骨乳突筋と胸骨舌骨筋の間、および舌骨筋の下にある頸動脈から左迷走神経を注意深く解剖します。
- カフを頭蓋骨に向かって皮下に導くトンネルを通します。金のピンを使用してリード線をヘッドキャップに接続します。
- 迷走神経をカフの内側に置き、カフ縫合糸に二重結び目を結んでデバイスを閉じます。鈍い非導電性フックで神経を操作したり、神経を取り巻く結合組織をつかんだりして、着床中に神経を損傷しないように注意してください。
- デバイスに刺激を加えてインプラントをテストします (0.8 mA、30 Hz、100 μs 二相性パルスの 10 秒列)。適切に移植すると、呼吸が停止し、SpO2 (末梢毛細血管酸素飽和度) が 5% 以上低下します。
- 金のピンと露出したリードを歯科用アクリルで覆い、縫合糸で傷を閉じ、切開部位を生理食塩水、アルコール、ポビドンヨード溶液で洗浄します。
- NIH ガイドラインおよび IACUC の承認に沿って、補充用輸液、鎮痛剤、術後ケアを提供します。
覚- 醒行動中に迷走神経を刺激します。
注: 動物が特定の運動タスクを実行する際の VNS (迷走神経刺激) の送達は、タスクに関連する筋肉組織の運動マップ表現を拡大することが以前に示されています。この検証済みのパラダイムを使用して、デバイスの使用の代表的な例を提供しますが、他の多くの行動パラダイムや刺激パラメーターは、代替アプリケーションに関連している可能性があります。ラットは、デバイスを埋め込む前に、ここで使用されるレバープレスタスクに習熟するように訓練されました。手術後、VNS送達前に良好なパフォーマンスが再び検証されました:ラットは、1日2回の30分間のトレーニングセッションで少なくとも100回の成功した試験を実施しました。VNS は、5 日間にわたる 10 回のその後のトレーニング セッション中に正しいレバー プレスと組み合わせました。- 埋め込まれたヘッドキャップを介してラットを刺激発生器に接続し、適切な刺激設定に調整します。VNS誘発性運動皮質マップの再編成のために、各正しいレバープレスを、幅100μs、振幅800μAの15二相性パルスの単一列とペアにし、30Hzの周波数で配信します。
刺激- トレインは、レバープレスが成功するたびに検出された直後に、10回の30分間のトレーニングセッションを通じて配信されます。VNSの送達中は、オシロスコープを使用して、電流刺激の送達が成功したかどうかを監視します。
- 慢性的に埋め込まれたカフの機能を検証します。
- 最後の VNS ペア トレーニング セッションから 24 時間以内に、頭蓋内マイクロ刺激 (ICMS) を使用して、運動皮質の機能的体性マップを定量化します。
- 運動皮質のICMSマッピングのための麻酔導入後、30 Hz、0.8 mA電流刺激(100 μs二相性パルス)の10秒の列を適用してカフ機能を再度検証し、その結果、呼吸が停止し、SpO2レベルが少なくとも5%低下するはずです。
注: アプリケーションによっては、5%未満の信頼性の高いSpO2低下が観察された場合、またはより高い電流振幅(最大1.6 mA)がSpO2の少なくとも5%の減少を確実に生み出す場合、カフ機能は許容できると見なされる場合があります。呼吸の停止および/または SpO2 の確実な低下が観察されない場合は、インプラントの失敗を示します。
