光誘発聴覚刺激のためのマウス背側蝸牛核へのウイルス介在遺伝子導入

要約

出典: Kozin, E. D., et.al.聴覚経路の光遺伝学的刺激のためのマウス背側蝸牛核の直接可視化J. Vis. 経験。(2015年)

このビデオは、マウス背側蝸牛核(DCN)へのウイルス媒介遺伝子導入を実証し、光誘発性聴覚刺激を可能にします。光感受性イオンチャネルであるオプシンをコードするウイルスベクターは、開頭術と小脳吸引の後、直接アクセスするためにDCNに注入されます。発現したオプシンはニューロンを光によって活性化することを可能にし、光遺伝学を使用して聴覚経路応答を研究するためのモデルを提供します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 小脳吸引

1. 5フレンチ吸引を使用して、DCNが視覚的になるまで、DCNを覆う左小脳の最外側部分を吸引します(図1、右パネル)。左小脳の約1/4〜1/3を切除します。DCN に隣接する主なランドマークは、上半規管の膨大部です。
   注: 小脳の吸引はプロトコルの重要なステップです。小脳の指向性吸引は、出血を引き起こすため、吸引を複数回通過するのではなく、1回の試みで発生する場合に最もうまく実行されます。吸引を助けるために、顕微鏡の焦点面を、小脳の表面からわずかに遠位になるCNの予想される深さに設定します。焦点面をCNに設定すると、可視化が向上し、鮮明な画像が確保されます。
2. 吸引後、さらなる出血、脳脊髄液 (CSF) の蓄積、および DCN 上での小脳変位が予想されます。血液凝固を防ぐために、0.5 ccの滅菌生理食塩水を開頭術にすばやく点眼します。次に、歯のポイントと吸引を軽くたたく組み合わせて、DCN を直接視覚化するための経路を空けることができます。DCNの表面に直接触れないでください。

2. ウイルス媒介遺伝子導入と外科的回復のための圧迫マイクロインジェクション

1. DCN に上にある血液と CSF がなくなり、はっきりと見えたら、10 μl のハミルトン シリンジを使用して 2 分間にわたって DCN に圧迫マイクロインジェクションを行います。
2. 先端がDCNの表面の下に見えなくなるまで、マイクロマニピュレーターで針を導入します。
3. 最適な性能を得るには、45°などの浅いベベルを備えた33または34ゲージの針(34ゲージの針を備えた気密シリンジを使用)を使用して、鈍的外傷を最小限に抑え、薄くて浅い脳幹構造(厚さ<300μm)であるDCN内に注射量を局在させます。
   注:他のマイクロインジェクション機器も使用できます。理想的には、注入装置は、DCNを直接ターゲットにする必要がある場合にわずかな曲げを可能にするのに十分な柔軟性を備えている必要があります。さらに、マウスは呼吸により手順全体でわずかに動くため、器具はわずかな動きに耐えるのに十分な堅牢性を備えている必要があります。

3. 外科的回復

1. 注射直後に皮膚を再近似し、標準的な回復手順に従ってマウスが回復できるようにします。残りの小脳と瘢痕組織は、小脳の誤嚥によって引き起こされる空洞を埋めます。胸骨の横臥状態を維持するのに十分な意識が回復するまで、動物を常に監視してください。心拍数、呼吸数、摂食能力を監視します。
   注:手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒にケージに戻されません。
2. マウスが術後(症例の<5%)に円を描くように歩き始めた場合、通常は皮膚切開の閉鎖から2〜4時間後に、マウスは摂食が困難になる可能性が高いため、すぐにマウスを犠牲にします。この副作用は、小脳の誤嚥が原因である可能性があります。術後は動物の痛みを監視し、施設の基準に基づいて動物の快適さを確保するために適切な麻薬を投与する必要があります。感染の証拠がある場合は、抗生物質が必要になる場合があります。

結果

図1:部分的な小脳誤嚥は、背側蝸牛核へのアクセスを示しています。左パネル:マウスをホルダーに入れた後、頭蓋骨の後部に沿って皮膚と軟部組織を縦に切開し、首の軟部組織まで切り開きます。皮膚は側方化され、冠状縫合線の上に覆われている筋肉が除去されます。中央のパネル: 次に、小脳とその下にある背側蝸牛核の領域で開頭術が骨ロンジャーとともに完了します。右パネル:背側蝸牛核を露出させるために、背側蝸牛核が視覚化されるまで、5フレン...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
定位固定保持器	Stoelting	51500
5 フレンチ	対称性 外科用	2777914
デンタル ポイント	Henry Schein	100-8170
骨ロンジャー	ファイン外科ツール	16020-14
10 μl ハミルトンシリンジ	ハミルトン	7633-01
34 ゲージ、針	Hamilton	207434
Rongeurs	ファイン外科用ツール	16021-14

吸引