凍結行動を軽減するためのラットモデルにおける迷走神経刺激

要約

出典: Childs, J. E., et al.絶滅学習に関連する経路の可塑性を誘導するツールとしての迷走神経刺激。J. Vis. 経験。(2015年)

このビデオでは、凍結行動を軽減するためのラットモデルにおける迷走神経刺激 (VNS) の方法を示します。恐怖状態のラットは、音の再曝露中に VNS を受け取り、凍結が軽減され、その治療の可能性が明らかになります。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 聴覚恐怖条件付け

注: これらの実験の目標は消滅を促進することであるため、この恐怖条件付けプロトコルはほとんどのプロトコルよりも集中的です。簡単に消える軽度の恐怖条件付けでは、床効果によってこの強化が覆い隠される可能性があります。

1. 12時間の明暗サイクルで動物を飼育し、餌や水を自由に入手します。手術からの回復中は毎日動物を扱います。
2. 音の減衰チャンバーに収容されたオペラントボックスで構成されるコンディショニングおよびテスト装置をセットアップします(図1C)。オペラントボックスは、20 x 20 x 20 cmの透明なプラスチック壁を持ち、フットショックジェネレーターに接続されたステンレス鋼のグリッド床を備えています。ホワイトハウスライトを使用してチャンバーを照らし、ビデオ録画を行います。条件刺激(CS)として、9 kHz、85 dBの音圧レベル(SPL)トーンを使用します。
3. オペラントボックスの上のチャンバー内にあるデジタルカメラを使用して動作を記録します。ビヘイビアルームの外にあるコンピューターでセッションを表示および監視します。後で分析するためにビデオを保存します。
4. 各セッションの前後に70%エタノールでチャンバーを拭き、嗅覚の合図を排除します。
5. ラットを2日間恐怖状態にします(図2A)。ラットが1日目に5つのトーン(9 kHz、85 dB、30秒)を提示することにより、トーンを生来恐れていないことを確認します。凍結レベルが無視できるレベルであることを確認してください。
   連続
   1. 2 日間のそれぞれで 8 回のトーンとフットショック (1 秒、0.5 mA) のペアで最初のトーン プレゼンテーションに従います。2日目にもう一度トーンとフットショックの組み合わせを繰り返す。刺激間隔 (ISI) を 2 分から 4 分の間で変化させ、試行ごとに平均 3 分です。トーン中に衝撃が発生するポイントをランダム化します。
6. 3日目に、トーン/ショックの連想の強さをテストします。フットショックがない場合に、3、4、または5分(平均4分)のISIで4つのトーンを再生し、条件付き恐怖反応(CFR)の尺度として、トーン提示中および刺激間隔中の動物の凍結行動を記録します。
7. 4日目に、迷走神経刺激(VNS)または偽VNSによる絶滅トレーニングを開始します。
   1. 刺激装置のオスコネクタを刺激入力部位に挿入して、ラットを刺激装置に差し込みます。動物をチャンバーに入れます(図1A、1C)。刺激装置を 0.4 mA、500 Hz で 30 μs のパルス幅に設定します。刺激をトーンの開始の 150 ms 前に開始して、合計 30.15 秒の持続時間に設定します。動物を 4 つのトーンでプレイし、各トーン プレゼンテーションを VNS または偽の VNS とペアリングします。
8. オシロスコープを使用して、カフと入力部位の電気的完全性を定期的にテストします。
   1. 通常どおり動物を接続し、刺激装置からオシロスコープへの出力を分割します。
   2. オシロスコープの範囲を-20V〜+20Vに設定し、刺激を実行します。30Hzの刺激の波形は、オシロスコープに表示されるはずです。サイズが10Vを超える刺激は、インピーダンスが高く、刺激入力部位のカフまたは接続が不適切に機能していることを示しています。
9. 絶滅トレーニングに対するVNSの効果をテストするには、5日目に2回目のCFRテストを実行します。トーンプレゼンテーション中に凍結に費やした時間を記録し、最初のCFRテスト中に記録されたベースライン凍結と比較します。
10. 治療条件を知らされていない独立した観察者を使用してビデオを分析します。ストップウォッチを使用して、トーンプレゼンテーション中にフリーズに費やされた時間を測定します。凍結は、ラットが急速な呼吸、頭を下げ、足を広げる完全な不動と定義されます。凍結挙動の分析は、トーン提示中と刺激間間隔の2つのフェーズに分けることができます。

結果

図 1.迷走神経刺激と実験セットアップ(A) VNSに使用するセットアップの概略図。動物は、2本の白金イリジウムワイヤーが迷走神経に巻き付けられたカスタムメイドのカフ電極に皮下につながるヘッドキャップを介して刺激隔離ユニットに接続されます。(B)迷走神経の周りのカフ電極の配置。カフ電極をその周囲に縫合する前の外科的切開部と露出した迷走神経の顕微鏡写真。(C) 動物が刺激装置に接続された状態で、聴覚恐怖条件付けに使用されるセットアップの写真。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Betadine	Henry Schein	69066950
デジタルカメラ - Logitech ウェブカメラ C210	Logitech	B003LVZO88
Platinum イリジウム ワイヤー	Medwire	10IR9/49T
絶縁型パルス刺激装置モデル 2100	A-M Systems	720000
シノメーター 10 MHz シングル チャンネル オシロスコープ	シノメーター	CQ5010C
Extech 407730 40-130 デシベル デジタル サウンド レベル メーター	Extech Instruments	B000EWY67W
DSCK-C デュアル出力、スクランブル ショッカー	Kinder Scientific Co