圧死後のマウスの坐骨神経における軸索再生

要約

出典: Li, Q., et al.ほ乳類の軸索再生の研究 成体マウス後根神経節のin vivoエレクトロポレーションJ. Vis. 経験。(2018年)

このビデオは、圧傷後のマウス坐骨神経における軸索再生のプロセスを示しています。単離された神経は固定され、ニューロンで発現する蛍光タンパク質を使用して、軸索の成長を視覚化するためにイメージング用に準備されます。落射蛍光顕微鏡を使用して、損傷部位から軸索の再生を追跡し、再成長の程度を評価します。

プロトコル

1. 材料と試薬

1. 動物
   1. 実験には、体重30〜35 gの6週間齢の雌CF1マウスを使用します。
      注:マウスは、1/4インチのトウモロコシの穂軸寝具と営巣用の2インチの正方形の雛を備えた個別に換気された滅菌ケージにグループ収容されました(ケージあたり5匹のマウス)。ケージは制御された12時間の明暗サイクルで維持され、室温は19.4°Cから25°Cの間でした。マウスには、世界的なげっ歯類の食事と自動給水システムが与えられました。
2. Instruments
   1. 手術を効率的に行うには、次の手術器具を使用してください:腹腔内注射用の使い捨て注射器(27 G、1.0 mL)、毛皮バリカン、実体解剖顕微鏡、顕微手術鉗子、顕微手術用はさみ、小さな骨ロンジャーと滅菌不織布スポンジ。
      注:すべての器具と材料は、手術前にオートクレーブ滅菌されるか、生産者によって事前に滅菌されます。手術中、器具には無菌状態を維持するために 75% のアルコールが噴霧されます。
3. 麻酔液<ol style='list-style-type:decimal;'>麻
4. 酔液 #1 を使用して麻酔を誘発し、後根核 (DRG) 注射の前に麻酔液 #2 を使用して麻酔を維持します。
   1. 麻酔液#1を作るには、ケタミンとキシラジンを滅菌生理食塩水で最終濃度10 mg / mLおよび1.2 mg / mLに希釈します。
   2. 麻酔液#2を作るには、アベルチンを滅菌生理食塩水で最終濃度20 mg / mLに希釈します。

DNAプラスミドとRNAオリゴス

メーカー
1. のプロトコルに従って、市販のキットを使用してプラスミドを調製します。プラスミドDNAを滅菌脱イオン水で2.0 μg/μLの濃度に希釈します。
2. Fast Green色素溶液を添加して最終濃度0.005〜0.01%(v/v)にすると、注入中のDRGアウトラインがよりよく見えるようになります。
3. 低分子干渉RNA(siRNA)またはマイクロRNAオリゴヌクレオチド(マイクロRNAオリゴ)をメーカーが提供する対応するバッファーに溶解して、最終濃度50μMに達します。

マイクロインジェクションピペット

1. マイクロピペットプーラーを使用してキャピラリーガラスを引っ張り、引っ張ったキャピラリーガラスピペットの先端を顕微手術用ハサミで切断して、外径約50μmの開口部を作成します。次に、ガラスピペットをクリーンベンチでUV光の下で約20〜30分間滅菌します。
2. 滅菌したガラスピペットを、細胞内マイクロインジェクションディスペンスシステムに接続されたピペットホルダーに取り付けます。マイクロインジェクションシステムのパラメータを30 psiの圧力と8 msの持続時間に設定します。

エレクトロポレーションシステム

1. 電極を方形波エレクトロポレーションシステムに接続し、次のパラメータを設定します:35 Vで15ミリ秒のパルス、950ミリ秒の間隔でin vivoエレクトロポレーション。

灌流および固定溶液

1. パラホルムアルデヒド(PFA)粉末を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に4%(w / v)の濃度で溶解します。PFA溶液を4°Cで保存します。

2. 実験手順

1. L4 および L5 DRG の外科的曝露
   1. 以前に調製した麻酔液 #1 の腹腔内注射を使用してマウスを麻酔します (ケタミン 100 mg/kg 体重およびキシラジン 12 mg/kg 体重)。
   2. 毛皮バリカンで手術部位を剃ります。
      注:左坐骨神経圧傷の別の手術があるため、左後腿の毛皮を同時に剃ることができます。
   3. マウスを加熱したブランケット(35.0°C)の上に置き、温度プローブで直腸温度を監視します。
   4. 麻酔をテストするには、マウスのつま先と尻尾をつまんで行動反応を観察します。
   5. コルクボードにマウスの四本の手足をテープ
   で貼ります。
   6. 皮膚を切断する前に、ヨードフォア溶液で手術部位を拭き、75% アルコールを使用してヨードフォアを除去します。
   麻
   7. 酔中の乾燥を防ぐために、眼科用軟膏を目に塗ります。
   8. 切開する前に、腸骨稜の両側に細いマーカーペンで印を付けます。腸骨稜の 2 つの点を結ぶ線を引いて、L5 DRG の位置を識別しやすくします。
   9. マイクロハサミで腰の正中線に沿って3cmの切開を行います。さらに、多裂筋や腰最長筋などの傍棘筋をL3からS1棘突起から切り離し、L4-5とL5-6の椎間関節を露出させます。
   10. マイクロロンジャーを使用して、L4-5とL5-6の椎間関節を取り外します。さらに、L4とL5の左神経弓を除去して、DRGの背側を露出させます。
2. DRG 注射<ol style='list-style-type:decimal;'>
3. DRG 注射前に麻酔を維持するために、麻酔液 #2 (アベルチン 200 mg/kg 体重を含む) を腹腔内に注射します。
4. DNAプラスミドまたはRNAオリゴ(DRGあたり1 μL)をガラスキャピラリーピペットにロードします。
5. キャピラリーガラスピペットの先端をDRGに慎重に挿入します。
6. 細胞内マイクロインジェクションディスペンスシステム(30 psi、8 ms)を使用して、DNAプラスミドまたはRNAオリゴの1.0 μL溶液をDRGに徐々に注入します。
   注:注射時間は5分以上続く必要があります。

エレクトロポレーション

1. 電極の先端にPBSを落とします。
滅
2. 菌した角綿ガーゼで出血をきれいにします。
3. ターゲットDRGを電極でそっとつまみ、エレクトロポレーションシステムで5つの正方形の電気パルスを印加します。
4. 筋肉層と皮膚層をそれぞれ5-0ナイロン縫合糸で閉じます。
5. マウスを加熱した毛布(35.0°C)の上に置き、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで細心の注意を払います。マウスが麻酔から完全に回復したら、マウスをホームケージに戻します。
   注:マウスが37°Cのブランケット上の麻酔から完全に回復するまでに約60分かかります。イブプロフェン1錠(200mg)を1,000mlの水(0.2mg/ml)に溶かして毎日飲み、術後の痛みを和らげます。

坐骨神経クラッシュ

1. DRGエレクトロポレーションの2〜3日後(実験デザインに応じて)、麻酔液#2(アバーチン400 mg / kg体重)でマウスを腹腔内に麻酔します。
2. コルクボードにマウスの四本の手足をテープ
で貼ります。
3. 正中線に沿って左側に0.5cmの切開を1cm行います。大殿筋や梨状筋などの筋肉を縦方向に切断します。大坐骨孔と坐骨切痕の間の坐骨神経のセグメントを露出させます。
4. 顕微手術鉗子で神経を12秒間粉砕し、10-0ナイロン神経上縫合糸で圧傷部位に印を付けます。硬膜に結び目を作り、クラッシュ部位をマークします。
5. 筋肉と皮膚の層を5-0ナイロン縫合糸で閉じます。
6. マウスを加熱した毛布(35.0°C)の上に置き、胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を完全に回復するまで細心の注意を払います。マウスが麻酔から完全に回復したら、マウスをホームケージに戻します。
   注:マウスが37°Cのブランケットでの麻酔から完全に回復するまでに約60分かかります。イブプロフェン1錠(200mg)を1,000mlの水(0.2mg/ml)に溶かして毎日飲み、術後の痛みを和らげます。

マウス灌流、DRG、および坐骨神経の収穫

1. 坐骨神経の圧傷の2〜3日後(実験デザインに応じて)、麻酔液#2でマウスを腹腔内に麻酔します。
2. マウスにPBS(pH 7.4)を経心臓灌流し、続いて氷冷の4%パラホルムアルデヒド(PFA)(pH 7.5)をPBSで灌流します。
3. 灌流後、解剖顕微鏡下でマイクロハサミとマイクロ鉗子を使用して、膝の前の神経根および坐骨神経とともにDRGを慎重に分離します。坐骨神経を4°Cで一晩4%PFAに直接配置します。

蛍光標識感覚軸索のイメージングと測定

解剖
1. 顕微鏡下でマイクロハサミとマイクロ鉗子で固定坐骨神経に付着した組織と膜を慎重に剥がします。次に、4%PFAをPBSと交換し、神経を3回洗浄します。
2. 坐骨神経をスライドの上に置き、まっすぐに保ちます。神経の周囲に80 μLの退色防止溶液を加え、その上にカバーガラスを置きます。取り付けられた組織全体を圧力で平らにします。
3. 平らにした組織を、モザイク取得と画像処理用のアクセサリを備えた倒立落射蛍光顕微鏡に置きます。
   注:励起長と発光長は488nmと509nmです。また、複数の重なり合った画像を手動で撮影し、MosaicプラグインでImageJを使って画像をつなぎ合わせることも可能です。
4. 再生軸索の長さを測定するときは、坐骨神経内のすべての識別可能な蛍光標識軸索を、圧傷部位(10-0神経上縫合糸でマーク)から遠位軸索末端まで

追跡します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ECM 830 方形波エレクトロポレーションシステム	BTX Harvard Apparatus	45-0052	in vivo エレクトロポレーション用
Tweezertrodes 電極	BTX Harvard Apparatus	45-0524	in vivo エレクトロポレーション用、1 mm フラット
ピコスプリッツァーIII	カーインスツルメンテーション	1096	内マイクロインジェクションディスペンスシステム
ガラスキャピラリープーラーNARISHIGE		PC-10
ウケイ酸ガラスキャピラリー	プレシジョンインスツルメンツ株式会社	1902328
実体解剖顕微鏡	ライカ	M80
顕微手術 Rongeur	F.S.T	16221-14
顕微手術鉗	FST by DUMONT、スイス	11255-20	坐骨神経クラッシュ専用
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm、標準壁
テープ	フィッシャーブランド	15-901-30	マウスをコルクボードに固定するため
2, 2, 2-トリブロモエタノール (アバーチン)	シグマ・アルドリッチ	T48402	アバーチン原液
2-メチル-2-ブタノール	シグマ・アルドリッチ	152463	アバーチン原液
siRNA 蛍光ユニバーサルネガティブコントロール #1	シグマ・アルドリッチ	SIC003	によるノンターゲットsiRNA
Dy547によるミミックトランスフェクションコントロール	Dharmacon	CP-004500-01-05	を使用したノンターゲットマイクロRNA
	Invitrogen Purelink	K210016	GFPコーディングプラスミド調製
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	注射中のDRGアウトラインの可視化
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	麻酔導入
キシラジン	AnaSed	NDC 59399-110-20	酔導入
アセトアミノフェン	マクニール コンシューマーヘルスケア	NDC 50580-449-36	術後の痛みの緩和

パー細胞ホワールド子 蛍光microRNA 蛍光プラスミド調製キット 麻