外傷性脳損傷マウスへの神経細胞懸濁液の定位固定移植

要約

出典: Furmanski, O., et al.ヒト人工多能性幹細胞由来神経細胞の治療的移植によるマウス脳損傷の制御された皮質衝撃モデル。J. Vis. 経験。(2019年)

このビデオでは、外傷性脳損傷のマウスモデルにおいて、ヒト由来多能性幹細胞由来の神経細胞を深部皮質の灰白質と白質の境界に定位的に注入します。移植された細胞は組織に統合され、損傷した脳の機能回復と回路修復を促進します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 細胞懸濁液の定位固定移植

1. 頭蓋切除術の約 24 時間後に細胞移植手順を開始します。
2. 細胞移植装置と手術用品を準備します
   1. 創傷洗浄用の滅菌生理食塩水を1mLのスリップチップシリンジに充填します。25 Gの針をシリンジに取り付けて、灌漑を制御します。
   2. 免疫抑制のために、1 mLのスリップチップシリンジにCsA(シクロスポリンA)溶液を充填します。CsAシリンジに25G以上の針を取り付けます。手術の合間に必要に応じてCsAシリンジを補充します。
   3. 標準的な方法を使用して、外径1.0 mm(外径)のホウケイ酸ガラスキャピラリーピペットからガラス針を調製します。
   4. 細いピンセットを使用して、針先を直径約200μmに折ります。針の円筒形のシャフトが2.5cm以下であることを確認してください。
3. 10 μLシリンジで使用するようにシリンジポンプを校正します。流量を 0.2 μL/min に入力すると、総容量は 2.0 μL になります。
4. ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)懸濁液を調製します。
   1. 標準的な無菌取り扱い技術を使用して、細胞培養BSL-2(バイオセーフティレベル-2)フードですべての細胞取り扱いを実行します。
   2. 細胞型に定義された標準条件に従って、事前に細胞培養を調製してください。
      注:このデモンストレーションに示されている実験では、hiPS細胞に由来するさまざまな神経表現型細胞が使用されました。
   3. 細胞剥離溶液、またはその他の好ましい酵素的または化学的手段を使用して、細胞を単一細胞懸濁液に穏やかに解離させます。
   4. 懸濁液中の細胞をカウントし、懸濁液を1.7 mLのフリップトップ試験管で最小限の細胞培養培地(DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)など)で5 x 10⁴細胞/μLに希釈します。
   5. 移植については、次の注意事項に従ってください:
      1. 処置中は、細胞を37°Cで懸濁状態に維持します。
      2. 実質内注射を行う直前にのみシリンジをロードしてください
         注:細胞懸濁液を横向きに置くと、重力によってシリンジが沈降したり、シリンジの側面にくっついたりして、注入される細胞の数に不規則
      が生じる可能性があります。
      3. 1日に複数の細胞移植手順を実行する場合は、マウスあたり~5 x 10⁵細胞(10 μL懸濁液)を割り当てます。
5. 定位移植手術を行う
   圧縮
   1. 酸素源を備えたイソフルラン気化器に接続された麻酔導入チャンバーにマウスを置きます。~0.7 L/minの酸素で~3%イソフルランで麻酔を誘発します。
   2. マウスを麻酔ノーズコーンを取り付けた定位固定フレームに入れます。
      イヤー
      1. バーとバイトバーで頭を所定の位置に固定し、頭蓋骨の前頭骨が水平になるように頭の向きを合わせます。手術中は麻酔を 1.5%-2% イソフルランに維持します。
   3. 術前ケアと無菌準備を行います
      抗
      1. 生物質を含む保湿眼科軟膏を綿棒を使用して目に塗布します。
      2. 切開部位を滅菌生理食塩水で洗浄し、部位を洗浄し、縫合糸を緩めます。70%エタノールを綿棒でそっと塗布し、切開部位を滅菌します。
   4. 細いピンセットと眼科用ハサミを使用して縫合糸を取り除きます。手術部位と頭蓋切除術を豊富な滅菌生理食塩水で洗浄します。
      1. 皮質が過度のヘルニア、変色、血管新生の破壊、出血などの不適格な特徴を示している場合は、その動物を除外する必要があります。
   5. 細胞移植シリンジをロードします
      1. 細胞懸濁液を37°Cのインキュベーターから細胞培養バイオセーフティフードに移動します。チューブをそっと回転させるか軽くたたいて、均一な細胞懸濁液を確保します。
      2. マイクロピペッターを使用して、~7.5 μLの細胞懸濁液をプランジャー端からハミルトンシリンジにロードします。
         プラン
         1. ジャーの端を下に向けて、シリンジを~120°の角度で持ちます。サスペンションとプランジャーチップの間に気泡が入らないように注意しながら、プランジャーを挿入します。
      3. ガスケットアセンブリをピペットニードルに取り付け、次にニードルをシリンジに取り付けます。
      4. プランジャーを押して、細胞懸濁液をピペットニードルに移動します。懸濁液の流出に抵抗がある場合は、細いピンセットを使用して針先を折り、直径を大きくします。
   6. 注射器を定位固定注射器ポンプに取り付けます。プランジャーを進めて、シリンジポンプアセンブリが正しく機能していることを確認します。
   7. 針を射出の座標に移動します。
      1. 針先をブレグマに合わせます。X 座標と Y 座標を 0 に設定します。次に、針先を頭蓋切除術の上で、前縁の外側 2.0 mm、後方 -1.0 mm に移動します。針の先端を硬膜表面に接触させ、定位座標をZ = 0に設定します。
      針を
      2. 脳に導入する前に、プランジャーを押して細胞懸濁液が適切に流れていることを確認します。
      針
      3. を脳にZ = -1.4 mmの深さまで導入します。これらの定位座標は、移植片を深部皮質の灰白質と白質の境界に配置します。
   8. シリンジポンプを始動して、細胞懸濁液を注入します。ラボベンチタイマーを15分に設定し、タイマーを開始します。長作動距離顕微鏡を使用して、細胞懸濁液の流出を監視します。
      1. 注射中に手術部位を滅菌生理食塩水で洗浄し、組織の水分補給を維持します。
      2. 15分で、移植針をゆっくりと引き抜きます。手術部位を生理食塩水で洗浄し、切開部を縫合糸で閉じます。
   9. 術後ケアを行う
      1. 麻酔を中止してください。CsAを10mg/kgの用量で首筋に皮下注射して送達します。マウスを清潔で予熱した術後ケージに入れます。
      飲料
      2. 水中にアセトアミノフェン鎮痛剤を 1.0 mg/mL で提供します。
         注: 適切な施設動物管理使用委員会 (IACUC) の標準操作プロトコル (SOP) に従って、実験結果変数を考慮して鎮痛を提供します。
      水分
      3. 補給と回復を助けるために、湿らせた食物回収ケージを提供します。
6. マウスの生存期間中、10 mg / kgで毎日CsA注射を継続します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 ml シリンジ	Becton Dickinson (BD)	309659
1.7 ml フリップトップ試験管	Denville	C2170
10 マイクロリットルシリンジ	Hamilton	7635-01
25GPrecision Glide シリンジニードル	Becton Dickinson (BD)	305122
70% エタノール			お選びいただける製品、地域によって異なります
アセトアミノフェン経口懸濁液	タイレノール (子供用)		水中で 1 mg/ml に希釈
酔気化器	Vetland	0521-11-22
動物用ハンドリングクロス			デパートから購入
Betadine	Purdue Products	NDC-67618-151-32
圧縮酸素			選択した製品。地域によって異なります
シクロスポリン A	シグマ アルドリッチ	30024-100mg
ジメチルスルホキシド (DMSO)	シグマ アルドリッチ	D8418-500ml
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
電気テープ	3M Corporation		デパートから購入
ファインピンセット	ファインサイエンスツール	11254-20
鉗子	ファインサイエンスツール	91106-12
ガラスキャピラリーピペット、外径1mm、内径0.58mmワールド	プレシジョンインスツルメンツ	1B100F-3
高速ロータリーマイクロモーターキット	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
理想的なマイクロドリル	セルポイント サイエンティフィック	60-1000
インパクト ワン CCI ライカ バイオシステムズ用 1 体座固定インパクター		39463920
ソフルラン	バクスター	NDC-10019-360-60
ラボベンチタイマー	フィッシャーサイエンティフィック	14-649-17
マイクロピペットプーラー	MicroData Instruments, Inc.	PMP-102	どんなプーラーでも十分です
顕微鏡カバースリップ	フィッシャーブランド	12-545-E
顕微鏡スライド取り付け媒体			お好みの製品
ミラー			デパートから購入
ニードルホルダー止血剤	ファインサイエンスツール	12002-12
眼科用軟膏	Falcon Pharmaceuticals	NDC-61314-631-36
眼科用スプリングはさみ	Fine Science Tools	15018-10
プラスチックボックス			デパートから購入
プラスチックシリンダー			パートから購入
QSI 電動シリンジポンプ	Stoelting	53311
取り外し可能な針圧縮フィッティング	Hamilton	55750-01
小型げっ歯類定位固定フレーム	Stoelting	51925
小型ハサミ	ファインサイエンスツール	14060-09
StemPro Accutase	Invitrogen (ThermoFisher)	A1110501
滅菌アルコール準備パッド	Fisherbrand	06-669-62
滅菌綿棒/ケンダル綿棒	Tyco Healthcare	540500
滅菌生理食塩水	Hospira	NDC-0409-1966-07
ストップウォッチ (2)	Fisher Scientific	06-662-56
Superfrost Plus Gold 顕微鏡スライド	Fisherbrand	15-188-48
縫合糸 - 湾曲した針付き 5.0 シルク	オアシス	MV-682

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