α-シヌクレイン発現のエピジェネティックな調節のための神経前駆細胞のレンチウイルス形質導入

要約

出典: Tagliafierro, L., et al.エピゲノム編集ツールをヒト人工多能性幹細胞由来疾患モデルに効率的に送達するためのレンチウイルスベクタープラットフォーム。J. Vis. 経験。(2019年)

このビデオは、パーキンソン病の重要なタンパク質であるα-シヌクレインの標的エピジェネティック修飾のための神経前駆細胞(NPC)のレンチウイルス形質導入を示しています。このプロトコルは、メチルトランスフェラーゼを介したDNAメチル化を可能にし、遺伝子調節と潜在的な治療介入を研究するためのSNCA発現を減少させます。

プロトコル

1. ドーパミン作動性神経前駆細胞の分化

MD

1. NPC(中脳ドーパミン作動性神経前駆細胞)の解凍
   1. BMM(塩基性マトリックス膜)でコーティングされたプレートを準備し、完全なN2B27を温めます。10 mLの温かいDMEM / F12を15 mLのコニカルチューブに加えます。クライオバイアルを37°Cのヒートブロックに2分間置きます
      1. 細胞をクライオバイアルからDMEM / F12を含むチューブに移します。300 x g で 5 分間遠心分離します。
      2. 上清を吸引し、細胞を2 mLのN2B27に再懸濁し、細胞懸濁液をBMMコーティングプレートの1つのウェルに加えます。細胞を37°Cで5%CO₂でインキュベートします。

2. MD NPC の形質導入とメチル化変化の分析

1. MD NPC の形質導入
   1. MOI (感染の多重度) = 2 で LV (レンチウイルス ベクター) ガイド RNA/不活性化 Cas9-DNMT3A (DNA メチルトランスフェラーゼ酵素 3A) ベクターとの 70% コンフルエンスで MD NPC を形質導入します。形質導入後16時間でN2B27培地を交換します。
   2. 形質導入の48時間後に、N2B27を5μg/mLピューロマイシンとともに添加します。細胞をN2B27とピューロマイシンで3週間培養して、安定したMD NPC株を取得します。細胞は、下流のアプリケーション(DNA、RNA、タンパク質分析、表現型特性評価、凍結、継代)の準備ができています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
装置
15 mL コニカル遠心分離管	Corning	430791
6 ウェルプレート	Corning	3516
Allegra 25R 卓上遠心分離機	ベックマン コールター	369434
倒立蛍光顕微鏡	ライカ	DM IRB2
細胞培養試薬
抗生物質 - 抗真菌溶液、100X	シグマ アルドリッチ	A5955-100ML
B-27 サプリメント (50X)、ビタミン A マイナス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12587010
コーニング マトリゲル hESC 認定マトリックス	コーニング	08-774-552
DMEM-F12	ロンザ	12-719
N-2 サプリメント (100X)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17502001
神経基礎培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21103049