マウスにおける子宮内ウイルス形質導入

要約

出典: Lutz, D., et al.発育中のマウス脳と脊髄の子宮内形質導入後の超微細構造神経可塑性パラメータの評価。J. Vis. 経験。(2019)。

このビデオは、マウス胚における子宮内注射によるウイルス形質導入を示しています。妊娠中のマウスを手術のために準備し、子宮角を露出させるために正中線を切開します。目的の遺伝子を含むウイルスと追跡色素の混合物を、標的部位の子宮嚢内の胚に注入します。次に、縫合する前に子宮角を元に戻します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.子宮内形質導入:

1. pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で、目的の標的(4 x 10、¹¹ウイルス粒子/ μLのAAV1)をコードするアデノ随伴ウイルス1型(AAV1)を調製します。0.1 mg/μL のファストグリーンを加え、AAV1-ファストグリーン混合物を37°Cに保ちます。
2. マイクロピペットプーラーを使用して、所望の形状(長さ8 mm、外径80 μm、内径50 μm)の細い毛細管チップを調製します(設定:圧力= 500、熱= 700、引っ張り= 0、速度= 80、時間= 200、 材料表を参照)。毛細血管の先端を4〜5mmになるように壊します。
3. アスピレーターチューブ(44 cm x 0.7 cm)をキャピラリーチップで組み立て、15 μLのAAV1-Fast-Green混合物をキャピラリーに吸引します。
4. 手順全体を通して、動物被験者を37°Cの一定の生理的体温に保ちます。
5. 妊娠中のC57Bl / 6マウス(胚14.5日目)をプレインキュベーションチャンバーに入れ、ガス状の4%イソフルラン(体積気流数0.6〜0.8 L / min)でマウスを麻酔します。
6. 皮下にブプレノルフィン(0.1 mg / kg体重)を注射します。
7. 麻酔をかけたマウスを予熱した手術プレート(37°C)に置きます。
8. 潤滑剤で目を覆います。
マウス
9. に麻酔マスク(体積気流数0.6〜0.8 L / minのガス状1.5%イソフルラン)を手術プレートに取り付け、腹部の皮膚領域を剃ります。剃った領域を3X 75%エタノールで拭き取り、次にベタジン溶液で拭きます。
   注:麻酔をかけたマウスの呼吸挙動を継続的に監視します。マウスの吸気-呼気パターンに応じてイソフルランガスの濃度を調整します。
10. マウスの後足指骨を絞って、足底反射がないかどうかを確認します。
11. 湾曲した鋸歯状の虹彩鉗子(10 cm)で皮膚をつかみ、まっすぐな炭化タングステンハサミ(10 cm)で正中線に沿って皮膚を切断し、次に、まっすぐなデュモンピンセット(12 cm、0.2 mm x 0.12 mm)で腹膜壁をつかみ、まっすぐなヴァンナはさみ(8 cm)で白線に沿って壁を切断します。
12. 腹部の開口部に有窓パラフィンフィルムを置き、マイクロモスキート止血鉗子(12.5 cm、湾曲)でフィルムの両端を固定します。
13. 子宮角内の胚への損傷を避けるために、スプーンのような装置で子宮角を露出させます。子宮角にPBS(37°C)を数滴垂らし、子宮嚢内の損傷や奇形がないか胚を検査します。
14. 子宮角の胚の順序と位置を記録します。注射の希望の位置に達するまで、子宮嚢内で胚を慎重に回転させます。
1
15. 〜2 μLのAAV1-Fast-Green混合物を注射部位(脳室など)と色素の浸透を実体顕微鏡で目視検査して注入します。
16. 注入された胚を記録し、注入された胚を含む子宮角を腹腔に戻します。
17. PBS(37°C)を数滴腹腔内に滴下します。ハルステッドの蚊止血鉗子(12.5 cm、湾曲)を使用して腹膜壁(ポリアミド6-0サイズの縫合糸を使用)と皮膚(ポリアミド3-0サイズの縫合糸を使用)を縫合して空洞を閉じます。または、単純な断続パターンまたはステンレス鋼の縫合糸/ステープルを使用して、腹腔と皮膚を閉じます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
26Gx 1'' 針	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump	Biomedical Instruments (Univentor)	8323102
アデノ随伴ウイルス血清型 1 (AAV1)	UKE (ウイルスコアファシリティ)	-	AAV1の参考文献とターゲット領域については、https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ およびまた、デザイナー遺伝子デリバリーベクター:分子工学と遺伝子導入を強化するためのアデノ関連ウイルスベクターの進化を参照してください。クォン・アイ、シェーファーDV。Pharm Res. 2008年3月;25(3):489-99.血清型1、2、および5のウイルスキャプシドで疑似型付けされた組換えAAVウイルスベクターは、中枢神経系の異なる領域に送達した後、異なる効率と細胞向性を示します。バーガー C、ゴルバチュク OS、ベラルド MJ、ペデン CS、ウィリアムズ P、ゾロトゥキン S、ライアー PJ、マンデル RJ、ムジチカ N. Mol。2004年8月;10(2):302-17.自己相補型組換えアデノ随伴ウイルス(scAAV)ベクターは、DNA合成とは無関係に効率的な形質導入を促進します。マッカーティDM、モナハンPE、サムルスキーRJ。ジーン・サー。2001年8月;8(16):1248-54。
エアポンプ	医学機器(Univentor)	Eheim 100
スピレーターチューンアセンブリSigma-Aldrich		A5177-5EA
呼吸マスクマウス陽極酸化アルミニウム	生物医学機器(Univentor)	-
ブプレノルフィン	Temgesic	アンプル鎮	痛剤
細血管	-製品	GB100TF-10	フィラメント付き
モンピンセット (#3、12 cm、ストレート、0.2 x 0.12 mm)	FST	11203-23
電気シェーバー	フィリップス	-
エチコン縫合糸 (エチロン、6-0 および 3-0)	エチコン	ポリ	アミド
目潤滑剤	ベパンテン	-
ファスト グリーン	シグマ アルドリッチ	F7252	注入された液体の視覚化用
ガスルーティングスイッチ 4/2コネクタ	バイオメディカル機器(Univentor)	8433020
Halsted Mosquito 止血鉗子(12.5 cm、ストレート)	FST	13011-12
マウス用誘導ボックス水平に動く蓋付き。内寸:LxBxH:155x115x130 mm.肉厚:6 mm	Biomedical Instruments(Univentor)	-
虹彩鉗子(10cm、湾曲、鋸歯状)	FST	14007-14
虹彩はさみ(11cm、ストレート、炭化タングステン)	FST	14501-14
イソフルランOP Tisch、電気加熱、sm外形寸法:257x110x18 mm加熱面積:190x90 mm呼吸マスクから逃げるイソフルランの除去は、規制に準拠して下向きです	生物医学機器(ユニベンター)	-
イソフルラン(アタネ)	JD医療吸入		麻酔光学
顕微鏡ベーシックDM E	ライカ	-	4x(N.A. 0.1 ∞/-)、10x(N.A. 0.22 ∞/0.17)、40x(N.A. 0.65 ∞/0.17)、100x(N.A. 1.25 ∞/0.17) 対物レンズ
ピペットプーレ	Science-Products	P-97
モスキート止血鉗子(12.5cm、湾曲)	FST	13010-12
サーモプーラー P-97	サッター インスツルメンツ
タイゴン 6/4 すべての部品を接続するためのチューブ材質外径:6mm内径:4mm肉厚:1mm	生物医学機器 (Univentor)
Vannas はさみ (8 cm、ストレート)	FST	15009-08

生物ア毛科学デュマイクロ