脳卒中後マウスモデルへのヒドロゲルの定位注射

要約

出典: Wilson, KL, et al.脳卒中後の脳へのヒドロゲル生体材料足場の注入 J. Vis. 経験。(2020年)

このビデオでは、脳卒中後のマウスの脳卒中コアへのヒドロゲルの定位固定注射を示し、細胞外マトリックスを模倣し、細胞浸潤を促進し、血管新生をサポートする足場形成におけるヒドロゲルの役割を強調し、脳卒中の回復におけるヒドロゲルの神経治療の可能性を強調しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

ハイドロゲルまたはその他の生体材料の注入

1. ユーザーが定義した時間に生体材料の注入を実行します。この実験では、脳卒中後5〜7日の間に注射が行われました。2〜6μLのヒドロゲルを注入します。
   1. 麻酔中のマウスの体温を維持するには、加熱パッドをオンにします(37°C)。
   2. オートクレーブ滅菌したはさみ、鉗子、綿、獣医用軟膏、外科用接着剤または縫合糸、滅菌アルコール、ベータヨウ素ワイプを準備します。滅菌ドリルビットヘッドを備えたボーンドリルと、金属製の30G針を備えた25 μLガラスハミルトンシリンジを準備します。
   3. ビーズ滅菌を160°Cにオンにして、マウス間で器具を滅菌できるようにします。
   4. 注入ポンプを定位固定装置に取り付けます。流量を1 μL/minに設定し、容量を4 μLに設定します。
   5. 手術後のマウスのために清潔なケージを準備します。
2. マウスをイソフルラン濃度4%の誘導チャンバーに入れ、自発的な動きが止まり、呼吸がゆっくりと安定した速度になるまで麻酔します。
   1. 眠りについたら、イソフルラン濃度を1.5%の維持でマウスを定位固定装置に移して固定します。
   2. 獣医の眼軟膏を両目に塗ります。
   3. マウスの頭から再生した可能性のある毛皮を剃り、アルコールワイプとベータヨウ素ワイプを使用してその領域を無菌的に準備します。3回繰り返します。
      注:必要に応じて、皮膚の炎症を引き起こし、手術後にマウスが頭蓋骨をかゆくため、最後に追加のアルコールワイプを使用してすべてのベータヨウ素を取り除きます。
3. 小さなはさみや鉗子を使用して、脳の上の皮膚を再び開きます。滅菌生理食塩水またはPBS(リン酸緩衝生理食塩水)を含む綿を使用して、頭蓋骨から破片を取り除きます。白黄色の円(ストローク、図1B)とドリルのバリ穴が表示されます。死んだ組織が見えない場合は、脳卒中は発生していない可能性があります。バリ穴がストロークの上の中央にない場合は、中央に穴を開け直します。
4. インジェクションポンプをマウスの上に置き、90°にロックします。材料をバックロードする前に、滅菌生理食塩水またはPBS溶液でシリンジを洗浄してください。
   1. きれいになったら、針がないようにガラス注射器を分解します。10 μLのヒドロゲル(または細胞の有無にかかわらず、ここでは他の生体材料)を含む25 μLの容積式ピペットを使用してシリンジをバックロードします。
   2. シリンジプランジャーを使用して、ジェルをシリンジの前まで押し込みます。次に、注射器を再組み立てし、ジェルが針から目に見えてにじみ出るまで押し続けます。
5. シリンジをポンプに置きます。シリンジが収まるようにポンプの背面を調整する必要がある場合があります。流量を30 μL/minに調整し、移動方向に応じてWithdrawalまたはInjectを選択して、Startを押します。ポンプの背面が正しい位置にあるら、停止を押します。
   1. シリンジがしっかりと固定されるようにポンプの背面をねじ込みます。以前に調整を行った場合は、流量が 1 μL/min に戻され、注入するように設定されていることを確認してください。
6. ポンプを x 方向と y 方向に動かして、穴の上に向けます。シリンジの針が穴の上部に触れるまで、ポンプをz方向に下に動かします。
7. デジタル・ディスプレイ・コンソールでZをリセットします。次に、シリンジをz方向に0.750mm下に動かします。注射器が曲がったり、抵抗があったりする場合は、頭蓋骨が治癒したか、完全に穴が開けられていないため、再穴を開ける必要があります。
8. ポンプコンソールの[開始]を押して、4 μL/分の速度で4〜6 μLのヒドロゲルを注入します。
9. ポンプが注入を停止するときに5分間のタイマーを設定して、ゲルが架橋を開始できるようにします。
10. 5分後、zノブを回してシリンジをゆっくりと引き上げます。誤って材料が引っ張られたり、穴から漏れたりしていないか注意してください。ポンプのロックを解除し、針が頭蓋骨から十分に離れたらマウスから遠ざ
けます。
11. 鉗子、外科用接着剤、または縫合糸を使用して、頭の上の皮膚を閉じます。マウスを清潔なケージに入れ、その回復を観察します。マウスが麻酔から回復するまでに約5〜10分かかるはずです。

結果

図1:ブレグマの概略図とストロークの局在化。 (A)頭頂葉は上部で出会い、ブレグマを形成します。レーザーの配置は、ブレグマの左 2.0 mm の中央に配置されました。(B) 脳卒中とバリ穴の目視確認は、脳卒中の 5 日後に見られました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
25uL ハミルトンシリンジ 702RN、針なし	Fishcer Scientific	14824663	生体材料の注入に使用されるシリンジ
25uL 容積式ピペット	Gilson	M-25
調整可能なステージプラットフォーム	Kopf機器	901
C57BL/6 マウス	ジャクソン研究所	664	8-12週齢
ケージアセンブリ Rob	Thorlabs	ER3-P4	3インチ 長さ、直径6mm、4パック - ステロタックスにレーザーを取り付ける用
棒	VWR	89031-288
CP 25 ピペットチップ	ルソン	F148012
プレート	Kopfインスツルメンツ	HP-4M
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center	VetEquip	901808
Jewlers 鉗子 #5	GFS ケミカル	46085
Miltex Adson ドレッシング鉗子、解剖グレード	Intefra Miltex	V96-118
ミニポンプ可変流量	Thomas Scientific	70730-064	ポンプ灌流マウス
ガス無気力ヘッドホルダー	Kopf Instruments	923-B
ナノジェットコントロールボックス	Chemyx	10050
ナノジェットポンプヘッダー	Chemxy	10051	生体材料針
RN 30G PT STY 3、0.5 インチ	Fishcer Scientific	NC9459562
非破裂イヤーバー 60º	Kopf Instruments	922
Puralube Vet 軟膏	Dr. Foster Smith	9N-76855
直腸プローブ	Kopf Instruments	Ret-3-ISO
Sol-M U-100 1/2 ユニットマーキング付きインスリンシリンジ 0.5 mL	VWR	10002-726	ローズベンガルを注入するには
StainTray スライド染色システム	Simport Scientific	M920-2	染色スライド用
立体移動装置	Kopf Instruments	940	小動物定位固定装置
学生用アドソン鉗子 - 1x2 歯	インサイエンスツール	91127-12
学生用ファイン鉗子 - ストレート/ブロードシャンク	ファインサイエンスツール	91113-10
温度コントローラー	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT コンパウンド	VWR	25608-930
Vetbond 組織接着性 3mL	サンタクルーズバイオテクノロジー	sc-361931

綿 ギ加熱マウス ファ