神経損傷のラットモデルにおける複合再生末梢神経界面の構築

要約

出典: Svientek, SR, et al.成体ラットにおける複合再生末梢神経界面(C‐RPNI)の作製 J. Vis. 経験。(2020)。

このビデオは、末梢神経損傷のラットモデルにおける複合再生末梢神経インターフェース(C-RPNI)の外科的構築を示しています。この手順では、切断された腓骨神経を筋肉移植片に取り付け、それを真皮皮膚移植片で重ねて神経再生を促進します。時間が経つにつれて、運動ニューロンと感覚ニューロンは移植片内の接続を再確立し、機能的な神経筋および感覚構造の形成を可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

注:ドナーラットは、皮膚および筋肉の提供手順の前に、食物と水への自由なアクセスが許可されています。安楽死は深部麻酔下で行われ、その後、両側気胸の二次的な方法で心臓内塩化カリウム注射が行われます。理論的には、この実験ではラットのあらゆる系統を利用できます。しかし、私たちの研究室は、生後2〜4か月のオスとメスのフィッシャーF344ラット(~200〜250 g)の両方で一貫した結果を達成しました。ドナーラットは、実験ラットと同型でなければなりません。

1.皮膚移植片の調製

ド

1. ナーラットを0.8〜1 L / minの酸素中の5%イソフルラン溶液を使用して、誘導チャンバーでドナーラットを麻酔します。ラットが麻酔されたら、誘導チャンバーから取り外し、再呼吸ノーズコーンの上に置き、麻酔を維持するためにイソフルランを2〜2.5%に下げます。
鎮
2. 痛のために、0.2 mLの滅菌生理食塩水に0.02〜0.03 mLのカルプロフェン(50 mg / mL)の溶液を肩甲骨の間に皮下投与します。
3. 角膜潰瘍を防ぐために、人工涙液軟膏を両目に塗ります。
4. バリカンを使用して、後肢下部全体、足首部分、および足の側面を剃ります。
5. 選択した後肢と足の足底表面をアルコールで洗浄し、続いてヨードポビドン溶液を洗浄し、最後にアルコールで洗浄して残留ヨードポビドンを除去します。
取り外し
6. 可能な丸い細かいグリット研磨石(4000rpm)を備えたハンドヘルドマイクロモーター高速ドリルを使用して、足の足底表面にバリを開けて表皮を取り除きます。バリをしながら、皮膚を火傷しないように生理食塩水を滴下してください。下にある真皮は、ピンポイントの出血を伴う光沢のある外観になります。
7. 血流を遅くするために下肢に止血帯を適用します。
8. #15メスで足底の皮膚を鋭く取り除き、乾燥を防ぐために生理食塩水で湿らせたガーゼに入れます。一部の腱組織および結合組織は、このステップで本質的に皮膚とともに除去され、後で除去されます。
9. 出血を遅らせるために、出血している足にガーゼラップを適用します。2つのコンストラクトを実行する場合は、手順1.5〜1.9を繰り返します。
10. 顕微鏡(倍率20倍)で、顕微鏡はさみを使用して皮膚移植片の深層から腱組織と結合組織を取り除きます。移植片に穴が開かないように注意してください。薄くした真皮移植片は、真皮のみを含むわずかに不透明で、サイズは約0.5 cm x 1.0cmです。
11. C-RPNIコンストラクトの製造の準備が整うまで、生理食塩水で湿らせたガーゼに入れます。移植片は収穫後2時間以内に使用する必要があります。

2. 筋肉移植片の準備

1. #15 メスで、足首のすぐ上から膝のすぐ下まで、後肢下部の前方に沿って縦方向の切開を行います。皮下組織を解剖して、下にある筋肉組織を露出させます。
2. 切開部の遠位面で、下肢の筋肉組織の腱挿入部を露出させます。前脛骨筋 (TA) は通常、筋肉の中で最大かつ最も前方にあり、この筋肉のすぐ下と後方には長指伸筋 (EDL) があります。遠位EDL腱をその領域の他の腱から分離し、この時点で挿入を切開しないように注意します。
3. 鉗子の両方の歯を腱の下に挿入し、鉗子を開いて上向きの圧力をかけて腱の逸脱を引き起こすことにより、正しい腱を確実に分離します。この腱を操作すると、すべてのつま先が同時に伸びるはずです。
4. 鋭利な虹彩はさみで遠位腱切開術を行い、腱切開術(または他の先端が鈍いはさみ)で周囲の組織から筋肉を鈍く分離し、近位部で腱の起源を見つけます。
5. 近位腱が視覚化されたら、鋭利な虹彩ハサミを使用して腱切開術を再度実行します。乾燥を防ぐために、筋肉移植片を生理食塩水で湿らせたガーゼに入れます。
6. ドナーラットからすべての所望の移植片が除去されたら、主に心臓内KCl注射(1〜2 mEq K + / kg)によって安楽死させ、続いて#15ブレードによる両側穿刺気胸による二次安楽死を行います。

3. 総腓骨神経の隔離と準備

1. 手順 1.1-1.3 で概説したプロトコルに従って、実験ラットに麻酔をかけ、鎮痛を提供します。
2. 希望の太ももを剃り、アルコール、ベタジンでクレンジングし、最後にアルコールでベタジンの痕跡を取り除きます。
3. 動物を手術準備テーブルから手術用顕微鏡テーブルに移動し、体温を維持するための温度プローブ付きの加熱パッドの上に置きます。イソフルランを2〜2.5%、酸素を0.8〜1 L / minに維持します。
坐
4. 骨切痕のすぐ遠位から膝の下部まで伸びる切開部に印を付けます。このマーキングは、大腿骨よりも劣っており、大腿骨から離れた角度になっている必要があります。#15 ブレードで切開し、下にある大腿二頭筋筋膜を切開します。
止
5. 血剤または先端が鈍いマイクロハサミを使用して、大腿二頭筋の下の空間まで大腿二頭筋を注意深く解剖します。
   注:坐骨神経は、最初に行われた切開とほぼ同じ方向に移動します。3つの枝があり、通常、腓腹神経が後部にあり、総腓骨神経と脛骨神経がそれぞれ膝の表面と深部に移動します。
6. 総腓骨 (CP) 神経を特定した後、先端の細いマイクロ鉗子とマイクロハサミを使用して、CP 神経を他の坐骨枝から慎重に分離し、遠位に残っている結合組織を除去します。
7. 神経が膝の表面を横切るポイントで、マイクロハサミで神経を鋭く切断します。
   注:神経に重大な外傷を引き起こすと神経腫形成のリスクが高まる可能性があるため、このステップでは鋭利なハサミを使用することが非常に重要です。
8. CP 神経から残っている結合組織を慎重に解放し、近位で神経を約 2 cm の長さまで解放します。

4. C-RPNIコンストラクトの製造

1. 生理食塩水で湿らせたガーゼから筋肉移植片を取り除き、すべての中央腱組織と筋外皮の小さな中央セグメントを除去します。腱の端はそのままにしておきます。
2. 8-0 の使用ナイロン縫合糸は、神経の両側に2つの断続した縫合で、CP神経の切断端の神経外膜を筋外膜のない筋肉移植片の領域に固定します。
3. 筋肉移植片を近位と遠位の両方に 6-0 ナイロン断続ステッチを 1 回使用し、神経と筋肉の接合部が大腿骨から反対側を向くように大腿骨骨膜に固定します。
   注: 筋肉が正常でリラックスした長さになるように筋肉を固定します。固定する際に筋肉を大きく伸ばしたり、弛緩を残しすぎ
たりしないようにしてください。
4. 8-0 を配置します筋肉移植片の骨外膜の下縁中央縁にナイロンステッチを縫い、筋肉移植片内の神経に弛緩を引き起こし、後の歩行でさらされる可能性のある将来の緊張を和らげるのに役立つ方法でCP神経神経上膜に固定します。
5. 生理食塩水で湿らせたガーゼから皮膚移植片を取り除き、神経と筋肉の大部分を完全に覆うように筋肉移植片に配置します。真皮の深い縁が筋肉の上に載っていることを確認してください。筋肉の境界を超えて伸びている真皮をトリミ
ングします。
6. 8-0を使用して、皮膚移植片を筋肉移植片に円周方向に固定しますナイロンは縫合糸を中断しました。通常、構造のサイズに応じて、合計4〜8本の縫合糸が使用されます。
7. 5-0クロム縫合糸でコンストラクト上の大腿二頭筋筋膜を走行方法で閉じます。
8. 上にある皮膚を 4-0 クロム縫合糸でランニング ファッションで閉じます。
9. アルコールパッドで手術部位を拭き取り、抗生物質軟膏を塗ります。
10. 吸入麻酔薬を中止し、ケージメイトから離れた食物と水源でラットが回復できるようにします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#15 Scalpel	Aspen Surgical, Inc	Ref 371115	リブバック炭素鋼手術用ブレード (#15)
4-0 クロム縫合糸	Ethicon	SKU# 1654G	P-3 逆切断針
5-0 クロム縫合糸	Ethicon	SKU#687G	P-3 リバースカッティングニードル
6-0 エチロン縫合糸	Ethicon	SKU# 697G	P-1 リバースカッティングニードル (ナイロン縫合糸)
8-0 モノフィラメント縫合糸	ARO手術用	T06A08N14-13	ネジ付きテーパー針上の黒色ポリアミドモノフィラメント縫合糸
実験用ラット	Envigo	F344-NH-sd	ラットはフィッシャー F344 株
フルリソ (イソフルオラン)	VetOne	13985-528-40	吸入麻酔マイクロ
モーター高速ドリル、ストーン	マスターメカニック	モデル151369	ヘルドロータリーツール付き。キットには複数の細かいグリットストーンが付属しています
	低温ガス	UN1072	標準医療グレードの酸素ボンベ
塩化カリ	APP 医薬品	63323-965-20	注射フォーム、2 mEq/mL
ポビドンヨウ素 USP	MediChoice	65517-0009-1	10% 局所溶液、複数の外科的準備に 1 本のボトルを使用できます
Puralube 獣医眼科軟膏	Dechra	17033-211-38	処置中に使用する角膜保護軟膏
Rimadyl (Caprofen)	Zoetis, Inc.	NADA# 141-199	注射剤、50 mg/mL
実体顕微鏡	ライカ	モデル M60	ユーザーは好みに合わせて倍率を調整できます
手術器具	ファインサイエンスツール	さまざまな	ユーザーは、個人の好みに応じて、または現在ラボで利用可能なものから機器を選択できます
プル抗生物質軟膏	MediChoice	39892-0830-2	軟膏は滅菌済みの使い捨てパケットに入っています
VaporStick 3	Surgivet	V7015	イソフルオランと酸素ボンベ用のスペースを備えた麻酔塔
Webcol Alcohol Prep	Coviden	Ref 6818	アルコール準備ワイプ。準備ごとに新しいワイプを使用して

ハンド 酸素極ウム トリ

ください