マイクロウェルアレイ内の細菌コロニーの光分解性ヒドロゲルベースの単離

要約

出典: Fattahi, N., et al.細菌のスクリーニング,選択及び単離のための光分解性ヒドロゲル界面J. Vis. 経験。(2021年)

このビデオでは、光分解性ヒドロゲルを使用してシリコンマイクロウェルアレイ内の細菌コロニーを単離する方法を示します。細菌細胞は最初にマイクロウェルにロードされ、架橋されたヒドロゲルにカプセル化され、異なるコロニーに培養されます。紫外線にさらされると、ヒドロゲルの標的分解により、個々のコロニーの選択的抽出が可能になります。

プロトコル

1. 細菌株と培養プロトコル

1. 適切な増殖培地を添加した寒天プレート上の細菌のコロニーをストリークします。本報告では、枯草菌(株1A1135、Bacillus Genetic Stock Center)をATGN(0.079 M KH₂PO₄、0.015 M(NH₄)₂SO₄、0.6 mM MgSO₄・7H₂O、0.06 mM CaCl₂・2H₂O、0.0071 mM MnSO₄・H₂O、0.125 M FeSO_4・7H₂O、 28 mMグルコース、pH:100 μg/mLアンピシリンを添加したATGN寒天プレート上に100 μg/mLスペクチノマイシンおよび大腸菌(株25922、ATCC)を添加した7 ± 0.2、15 g/L寒天培地プレート。
   注:これらの材料によるヒドロゲルのカプセル化および放出に関する以前の報告では、代わりにA.tumefaciens C58細胞
2. ATGN寒天プレートから目的のコロニーを選択し、一晩培養を開始します。ここで使用する大腸菌および枯草菌株の場合、ATGN液体培地中で215rpmで24時間振とうしながら、37°Cで培養します。細胞培養物を-80°Cの50%グリセロールで、将来の使用まで保存します。
3. 無菌接種ループを使用してグリセロールストックから両方の株のコロニーを選択し、ATGN液体培地中で37°Cおよび215rpmで24時間インキュベートします。

2.ヒドロゲル形成に必要な材料の調製

1. 光分解性ポリ(エチレングリコール)-o-ニトロベンジルジルジアクリレート(PEG-o-NB-ジアクリレート)合成
   注:PEG-o-NB-ジアクリレートの社内合成は十分に説明されており、以前に報告されています。あるいは、合成が日常的であるため、化学合成施設から外部委託することもできます。
2. 架橋バッファー
   細菌
   1. 株用に選択した培地のレシピを取り、2倍の栄養素を含む培地を調製します。リン酸塩、例えばNaH₂PO_4を培地に加え、最終濃度は100 mMになる。次に、5 M NaOH(aq)を使用してpH値を8に調整します。
   2. 緩衝液を滅菌し、さらに使用するまで-20°Cで保存します。
      注:これらの金属はチオールのジスルフィドへの酸化を触媒するため、培地中に存在する遷移金属は除外してください。
3. PEG-o-NB-ジアクリレート溶液
   ア
   1. リコートPEG-o-NB-ジアクリレート(分子量3,400 Da)粉末1mgごとに、3.08 μLの超純水を加えて、49 mM濃度のPEG-o-NB-ジアクリレート(アクリレート濃度98 mM)にします。
   2. 溶液が十分に混合されるまでボルテックスし、さらに使用するまでこの溶液を-20°Cで保存します。
4. 4 アーム PEG-チオール溶液
   1. 4 アーム PEG-チオール(分子量 10,000 Da)の調製では、粉末 mg あたり 4 μL の超純水を加えて、20 mM 濃度(チオール濃度 80 mM)に達します。
   2. この溶液がよく混合されるまでボルテックスし、さらに使用するまでこの溶液を-20°Cで保存します。

5. シリコンマイクロウェルアレイの

1. 製造 パリレンコーティング: 以前の研究論文で説明した標準プロトコルを使用して、シリコンウェーハをパリレンでコーティングします。
2. 微細加工:文献に記載されているプロトコルに従って、マイクロウェルアレイを設計および製造します(図1)。
   注:標準的なフォトリソグラフィー技術を適用して、パリレンコーティングされたシリコンウェーハ上にマイクロウェルアレイを製造しました。

7.マイクロウェルアレイ上のヒドロゲル形成マイクロ

1. ウェルアレイ
   注:700 μLの0.1 OD₆₀₀(波長600 nmでの光学密度)の細胞懸濁液をマイクロウェルアレイ基板上に播種し、パリレンリフトオフ法を適用してバックグラウンドから細胞を除去しました。
2. 5.6 μLのPEG-o-NB-ジアクリレートと12.5 μLのpH 8リン酸緩衝生理食塩水ATGNを加え、6.9 μLの4アームPEGチオール溶液と混合することにより、ヒドロゲル前駆体溶液を調製します。
3. 非反応性のパーフルオロアルキル化スライドガラス上で12.5 μLの前駆体溶液をピペットで移動し、細胞を接種したマイクロウェルアレイ基板の反対側に2つの38 μmスチールスペーサー( 材料表を参照)を配置します。
4. ペルフルオロアルキル化スライドガラスを前駆体溶液液滴で反転させ、液滴をマイクロウェル基板の中央に置きます。次に、ヒドロゲル形成のために室温(RT)で25分間インキュベートします。
5. スライドガラスをマイクロウェル基板からそっと取り除きます。ヒドロゲル膜は、マイクロウェル基板に付着したままにする必要があります。

結果

図1:マイクロウェルアレイの設計と製造。(A)標準的な微細加工技術を適用して、マイクロウェルアレイを製造しました。シリコンウエハ。(B)各基板は、深さ20μm、ピッチ30μmの直径10μmウェルの7 x 7アレイで構成されていました。(C)各アレイは225個のマイクロウェルで構成されていました。この図は、Barua et al.著作権 2021 フロンティアズ メ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
硫酸アンモニウム	Fisher Chemical	A702-500	認定 ACS 粒状
枯草菌 1A1135	Bacillus Genetic Stock Center	1A1135
明視野正立顕微鏡	Olympusコーポレーション	BX51
塩化カルシウム、無水	ッシャー ケミカル	C614-500	デシケーター ペレット用、4-20 メッシュ
DOWSIL 184 シリコーン エラストマー ベース	ダウ シリコーン コーポレーション		保管温度: -30-60 °C
DOWSIL 184 シリコーン エラストマー硬化剤	ダウ シリコーン コーポレーション		保管温度: < 32 C
EPOCH2マイクロプレート分光光度計	BioTek Instruments	EPOCH2
大腸菌 ATCC 25922	サーモフィッシャー科学	R19020
エタノール、無水	フィッシャーケミカル	459844
フィッシャーフィッシャーフィックのプレミアム顕微鏡スライド プレーン	フィッシャーサイエンティフィ	12-544-4
過酸化水素溶液	シグマ・アルドリッチ	216763-500ML	害剤、H2O
イソプロパノール	シグマ・アルドリッチ	190764
硫酸マグネシウム、7 水和物	マクロン・ファイン・ケミカルズ	6066-04	アバントール・パフォーマンス・マテリアルズ社
メタノール	Sigma-Aldrich	179337-4L	ACS 試薬、> 99.8%
窒素、圧縮	Matheson	UN1066
ペンタエリスリトール テトラ (メルカプトエチル) ポリオキシエチレン (4 アーム-PEG)	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	15 の間に保管°C–30 °C
プレミアム顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィ	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
塩化ナトリウム	シグマライフサイエンス	S5886-500G	バイオ試薬、細胞培養に適しています
水酸化ナトリウム	シグマ-アルドリッチ	S8045-500G	BioXtra、> 98%、ペレット(無水)
リン酸ナトリウム一塩基二水和物	シグマ・アルドリッチ	71505-250G	BioUltra、分子生物学用、> 99.0%(T)
ステンレス鋼厚さ計	ブランド製品	77739

フィック 阻 30 wt% を含む ック 精密