グラム陰性菌の内膜画分と外膜画分の分離

要約

出典:Cian、MB et al.、アシネトバクターバウマンニの技術的調整によるグラム陰性菌の細胞エンベロープの内膜画分と外膜画分の分離。J. Vis. 経験。(2020年)

このビデオでは、スクロース勾配超遠心分離法を使用したグラム陰性菌の内膜画分と外膜画分の分離を示します。膜画分は精製され、膜特異的成分の標的分析のために低温で保存されます。

プロトコル

1. 膜抽出用の一般的な試薬および培地の調製

細菌

1. 増殖培地: 完全に洗浄され、オートクレーブ滅菌された 2 L フラスコで 1 L のブロス培地を調製し、滅菌します。
2. 一般的な再懸濁バッファー(1 Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンバッファー(トリスバッファー)pH 7.5;50 mL):6.05 gのトリス塩基を30 mLのH₂Oに溶解し、5 M HClでpHを7.5に調整します。超高純度H₂Oで最終容量を50 mLに調整します。
3. 二価陽イオンキレート化溶液(0.5 Mエチレンジアミン四酢酸、EDTA pH 8、100 mL)のマスターストック:18.6 gのエチレン四酢酸二ナトリウム·2H₂Oを80 mLのH₂Oに加え、激しく攪拌し、水酸化ナトリウム(NaOH)でpHを8.0に調整します。超高純度H₂O.
   注:EDTAの二ナトリウム塩は、NaOHの添加によって溶液のpHが~8.0に調整されるまで溶解しません。
4. 浸透圧緩衝液A(0.5 Mスクロース、10 mM Tris pH 7.5、1 L):171.15 gのスクロースを秤量し、1 Lシリンダーに移します。10 mLの1 M Tris pH 7.5を加えます。超高純度H₂Oで最終容量1 Lに調整し、4°Cで保存します。
5. リゾチーム(10 mg / mL、5 mL):50 mgの(鶏卵白)リゾチームを秤量し、5 mLの超高純H₂Oに溶解し、4°Cで保存します。
6. 希釈二価カチオンキレート溶液(1.5 mM EDTA、500 mL):1.5 mLの0.5 M EDTA(ステップ1.3)を497.5 mL超高純度H₂Oに加え、4°Cで保存します。
7. 浸透圧緩衝液B(0.2 Mスクロース、10 mM Tris pH 7.5、2 L):136.8 gのスクロースを秤量し、2 Lシリンダーに移します。20 mLの1 M Tris pH 7.5を加えます。超高純度H₂Oで最終容量を2 Lに調整し、4°Cで保存します。
8. ヌクレアーゼ補因子(1 M塩化マグネシウム、MgCl₂; 10 mL):2.03 gのMgCl₂・6H₂Oを8 mLの超高純度H₂Oに溶解します。容量を10 mLに調整します。室温で保管してください。
9. RNaseおよびDNase酵素を含むヌクレアーゼ溶液カクテル:材料表を参照してください。-20°Cで保管してください。
10. プロテアーゼ阻害剤カクテル:材料表を参照してください。4°Cで保存してください。
11. 低密度等密度スクロース勾配溶液(20%w / vスクロース、1 mM EDTA、1 mM Tris pH 7.5溶液、100 mL):20 gのスクロースを秤量し、200 mLシリンダーに移します。100 μLの1 M TrisバッファーpH 7.5と200 μLの0.5 M EDTA pH 8を加えます。超高純度H₂Oで最終容量を100 mLに調整し、室温で保存します。
12. 中密度等密度スクロース勾配溶液(53%w / vスクロース、1 mM EDTA、1 mM Tris pH 7.5溶液、100 mL):53 gのスクロースを秤量し、200 mLメスシリンダーに移します。100 μLの1 M TrisバッファーpH 7.5と200 μLの0.5 M EDTA pH 8を加えます。超高純度H₂Oで最終容量を100 mLに調整し、室温で保存します。
    注:スクロースの割合が高いため、精度を確保するために、この溶液をメスシリンダーで調製します。磁気撹拌バーを加え、スクロースが溶液に完全に溶解するまで撹拌します。このプロセスには数時間かかる場合があります。
13. 高密度等密度スクロース勾配溶液(73%w / vスクロース、1 mM EDTA、1 mM Tris pH 7.5溶液、100 mL):73 gのスクロースを秤量し、200 mLメスシリンダーに移します。100 μLの1 M TrisバッファーpH 7.5と200 μLの0.5 M EDTA pH 8を加えます。超高純度H₂Oで最終容量を100mLに調整し、室温で保存します。
    注:スクロースの割合が高いため、精度を確保するために、この溶液をメスシリンダーで調製します。磁気攪拌棒を加え、ショ糖が完全に溶解するまでかき混ぜます。このプロセスには数時間かかる場合があります。
14. 単離膜保存バッファー(10 mM Tris Buffer pH 7.5; 1 L):1 mL の 1 M Tris Buffer pH 7.5 を 1 L フラスコに加え、超高純度 H₂O で最終容量を 1 L に調整します。

2.膜抽出のための細菌の調製

凍結

1. グリセロールストックから細菌を新鮮な寒天プレートにストリークします。コロニーが発達したら、プレートを4°Cで保存します。ブロス培地で満たされた5mLチューブに単一のコロニーを接種し、必要に応じて細菌を一晩培養します。
2. 一晩の細菌培養物を1 Lの好ましいブロス培地に逆希釈し、所望の光学密度が達成されるまで細菌を培養します。
   注:成長表現型を抑制する傾向がある変異遺伝子型には、1 Lのブロス培地に単一の細菌コロニーを接種することをお勧めしますが、一部のグラム陰性菌は他の細菌よりも成長が遅いだけです。単一コロニー接種によって十分な培養密度を達成できない場合は、一晩培養を1 Lの培地に逆希釈することが、増殖を同期させるための1つの戦略です。細菌膜組成は、培養の成長段階(対数期と固定期)によって異なります。細菌培養の光学密度の変化を時間の関数として測定する成長曲線は、培養密度を成長段階と相関させるために、すべての菌株で実行する必要があります。
3. ブロス培養物の入ったフラスコを氷の上に置きます。600 nm(OD₆₀₀)での光学密度を読み取り、6.0〜8.0 x 10¹¹細菌コロニー形成単位(CFU)に相当する培養量を計算します。チフス菌の場合、OD600 が 0.6 - 0.8 の OD 600 は約 1.0x10⁹ CFU/mL に等しいため、これは OD₆₀₀ で 1 L の培養物に相当します。この容量を遠心分離管に加え、残りの培養物が使用されるまで氷上に留まるようにします。
固定
4. 角度の高速遠心分離機で7,000〜10,000 x gで4°Cで10分間遠心分離することにより、細菌をペレット化します。
   注:遠心分離機を予冷し、低温に維持します。手順全体を通して、サンプルを氷上に維持します。
5. デカントして上清を慎重に廃棄します。
   注:膜画分をすぐに抽出しない場合は、ペレットを急速凍結および/または-80°Cで保存できます。ただし、特に非腸内細菌種の場合は、細胞が採取されたのと同じ日に原形質分解を直接進めることをお勧めします。

3. 外膜の解離と原形質分解

細胞ペ

1. レットが以前に-80°Cで保存されていた場合は、氷上で解凍し、残りの手順の間、サンプルを氷上に保持します。遠心分離管内の各細胞ペレットを12.5 mLのバッファーAに再懸濁します。細胞の懸濁液に磁気撹拌棒を追加します。
2. 180 μLの10 mg / mLリゾチーム(最終濃度144 μg / mL)を各細胞再懸濁液に加えます。サンプルを氷上に置き、2分間攪拌します。
3. 各細胞再懸濁液に12.5 mLの1.5 mM EDTA溶液を加え、氷上でさらに7分間攪拌を続けます。
懸
4. 濁液を50 mLのコニカルチューブにデカントし、9,000〜11,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
5. 上清をバイオハザード廃棄物容器に廃棄し、ペレットを氷上に保持します。
6. 25 mLのバッファーBを細胞ペレットに加えます。
7. 55 μLの1 M MgCl₂、1 μLのRNase/DNaseヌクレアーゼ試薬(均質化前に原形質分解を受ける細菌に関連する粘度の問題を回避するため)、および1 μLのプロテアーゼ阻害剤カクテルを、細胞ペレットの上にあるバッファーBの容量に加え
ます
8. ペレットをバッファーB混合物に再懸濁します。均質な溶液が観察されるまで、激しくピペットとボルテックスをします。
   注:このプロトコルのステップ4に進む前に、均質な溶液を用意することが非常に重要です。再懸濁された細胞は、粘性のあるケーキ生地のような外観と粘稠度を有するはずです。
9. 各サンプルを15秒間ボルテックスします。懸濁液を氷上に保持し、ステップ4に進みます。

4. 加圧均質化と溶解
注: 溶解にはいくつかの方法を使用できます。超音波処理は熱が発生するため理想的ではありません。浸透圧溶解は達成できますが、多くの場合非効率的です。そのため、高圧溶解をお勧めします。高圧溶解は、さまざまな機器を使用して達成できます。フレンチプレスやエムスリフレックスなどの均質化機をお勧めします。私たちは、高浸透圧ショ糖溶液に対する反応が異なる多くの種類のグラム陰性菌を扱っています。高圧均質化ステップにより、効率、再現性、歩留まりが向上します。

1. フレンチプレスセルを4°Cで予冷するか、ホモジナイザーマシンの金属コイルを氷の上に挿入します。
2. サンプルをフレンチプレッシャーセルまたはホモジナイザーサンプルシリンダーに注ぎ、セルを所望の均質化圧力下に置きます(フレンチプレスを使用する場合は10,000 psi、ホモジナイザーを使用する場合は20,000 psiで十分です)。
フ
3. レンチプレスを使用する場合は、圧力を維持しながら出口流量を毎秒約1滴に調整してください。
4. サンプルを氷上に保ちながら、細胞ライセートを50 mLのコニカルチューブに収集します。
5. ステップ4.2〜4.4を3〜5回繰り返して、サンプルの透明度が徐々に増加することによって示される完全な溶解を達成します。
   注:サンプルチャンバーを洗浄し、サンプルの間にバッファーBで平衡化する必要があります。
6. 溶解した細胞を氷の上に置いてください。

5. 全膜分画

1. 溶解した細菌サンプルを6,169 x g で4°Cで10分間遠心分離し、残りの無傷の細胞材料をペレット化します。(例えば、未溶解の細菌細胞)。
2. 均質化された膜を含む上清の残りの部分を、超遠心分離のためにポリカーボネートボトルに分配します。
   注意:必要に応じて、バッファーBで希釈することで細胞サンプルのバランスをとることができます。
3. 細胞溶解物を184,500 x g で4°Cで少なくとも1時間超遠心分離します。このステップは、膜の品質に影響を与えることなく、一晩で実行できます。
4. 超遠心チューブに存在する残りの上清を廃棄し、膜ペレットを氷上に保持します(図1)。
5. ガラス-Dounceホモジナイザーを使用して、1 mLの低密度等密度-スクロース勾配溶液にメンブレンペレットを再懸濁します。ガラスパスツールピペットを使用してサンプルホモジネートを1.5 mL微量遠心チューブに移し、氷上に保持します。
   注:全膜組成分析のみが必要な場合は、1 mLの低密度等密度-スクロース勾配溶液を1 mLの単離膜保存バッファーに置き換えます。ステップ5.5は、全細菌膜サンプルのみが必要な場合の単離のエンドポイントです。さらなる下流分析が必要になるまで、サンプルを-20°Cで保存してください。

6. 二重膜を分離するための密度勾配超遠心

分離 ス

1. イングバケットローターと超遠心分離機用に指定された13 mLポリプロピレンまたは超透明オープントップチューブを適切な数集
めます。
2. チューブを少し傾けた位置に持ち、スクロース溶液を高密度から低密度に次の順序でゆっくりと加えてスクロース勾配を調製します:2 mLの73%w / vスクロース、1 mM EDTA、1 mM Tris pH 7.54 mLの53%w / vスクロース、1 mM EDTA、1 mM Tris pH 7.5
   1. 次に、 20%w / vスクロース溶液に再懸濁した全膜画分(1 mL)を加えます(ステップ5.5)。膜画分をその下にあるスクロース溶液と混合しないでください。これらの各レイヤーの間に分割が表示されるはずです。
   2. 最後に、低密度等密度スクロース勾配溶液(約6 mL)をチューブに充填します。ポリプロピレンおよび超透明のオープントップチューブは、チューブのサポートのためにできるだけいっぱい(チューブ上部から2〜3 mm)充填する必要があります。
3. Acinetobacter baumannii 17978
   1. 調整されたスクロース勾配をさまざまな細菌検体で使用できるように適応させます。A. baumanniiの場合、以下のスクロース勾配により、膜のより完全な分離が得られました(図2).2 mLの73%w/vスクロース、1 mM EDTA、1 mM Tris pH 7.54 mLの45%w/vスクロース、1 mM EDTA、1 mM Tris pH 7.5
   次に
   2. 、20%w/vスクロース溶液に再懸濁した全膜画分(1 mL)を加えます(ステップ5.5)。膜画分をその下にあるスクロース溶液と混合しないでください。これらの各レイヤーの間に分割が表示されるはずです。
   3. 最後に、チューブに低密度等密度スクロース勾配溶液(約6 mL)を充填します。ポリプロピレンおよび超透明のオープントップチューブは、チューブのサポートのためにできるだけいっぱい(チューブ上部から2〜3 mm)充填する必要があります。
ス
4. イングバケットローターを使用して、サンプルを288,000 x g、4°Cで一晩超遠心分離します。
   注:前の手順で使用した容量については、16時間から23時間の遠心分離時間をお勧めします。
5. P1000ピペットチップの端をポイントから約5mmカットします。ピペットを使用して、上部茶色の内膜(IM)層を取り除きます。IM画分をポリカーボネートボトルに移して超遠心分離します。
6. 53〜73%界面の上に約2mLのスクロース溶液を残して、下部の白色外膜(OM)がIM画分で相互汚染されないようにします。OM画分についてステップ6.4からピペッティング手順を繰り返します(図1)。
   注:膜は、下部の遠心分離管に針で穴を開け、フラクションとして滴下することによっても収集できます。
7. 超遠心分離管の残りの空隙を単離膜保存バッファーで満たし、反転またはピペッティングで混合します。サンプルを氷上に保持します。
8. 洗浄および単離した膜を、184,500 x g で4°Cで1時間超遠心分離することにより収集します。
9. 上清を廃棄し、Dounce均質化によって膜を再懸濁します。500〜1000 μLの保存バッファーを追加します。2 mLの微量遠心チューブにサンプルを採取します。
10. 細菌膜サンプルを-20°Cで保存します。

結果

図1:この方法の記事で説明されているグラム陰性菌膜分離手順を示す概略図。 細菌細胞を収集し、総膜、内膜(IM)、および外膜(OM)を単離するために使用される手順が示されています。このアプローチは、IM二重層の密度と比較して、これらの微生物のOM二重層の密度の増加に依存しています。

材料