細菌における無機ポリリン酸塩の定量のためのアッセイ

要約

出典: Pokhrel, A., et al.細菌における無機ポリりん酸塩の分析J. Vis. 経験。(2019)。

このビデオでは、細菌サンプル中の無機ポリリン酸塩(polyP)を測定するための比色アッセイを示します。この手順では、ポリPを酵素的に変換して遊離リン酸に変換し、モリブデン酸塩およびアスコルビン酸と反応して青色の複合体を生成します。この複合体の吸光度を既知のリン酸塩濃度の標準曲線と比較することにより、細菌サンプル中のポリP含有量を正確に定量できます。

プロトコル

1. ポリリン酸塩抽出のためのサンプルの採取

1. polyP 含有量を決定するために目的の条件下で細菌を増殖させます。このプロトコルでは、システイン(MEI-C)を含まないリンゴ酸酵素誘導(MEI)培地で振とうことなく、37°Cでラクトバチルス・ロイテリ
を一晩増殖させます。
2. 1.5 mLの微量遠心チューブで遠心分離して、合計50〜100 μgの細胞タンパク質に十分な細胞を回収します(以下のステップ3を参照)。大腸菌の場合、これは0.2〜0.4のA₆₀₀での対数期培養1mLです。L. reuteri の場合、これは 1 mL の一晩培養です。必要に応じて、関心のある他の種に調整します。
3. 細胞ペレットから上清を完全に除去します。
4. 細胞ペレットを250 μLのGITC溶解バッファー(4 Mグアニジンイソチオシアネート、50 mM Tris-HCl、pH 7)に再懸濁し、95°Cで10分間インキュベートして溶解します。-80°Cで溶解物を保存します。
   注:高温で長時間インキュベートすると、加水分解によるポリPの分解が生じる可能性があるため、溶解時間と一致させてください。ライセートは-80°Cで無期限に保存できます。
   注意:グアニジンイソチオシアネートはカオトロピック塩であり、手袋をして取り扱い、有害廃棄物として処分する必要があります。

2. 細胞溶解物のタンパク質含有量の測定

1. 0、0.1、0.2、および0.4 mgのBSA ^mL-1を含むウシ血清アルブミン(BSA)標準をGITC溶解バッファーで調製します。
   注:GITCはブラッドフォードアッセイの発色に影響を与えるため、GITCでBSA標準を作成することが重要です。BSA標準は-20°Cで無期限に保存できます。
2. 解凍し、よく混合した細胞ライセートとBSA標準試料5 μLをアリコートして、透明な96ウェルプレートでウェルを分離します。
3. 各ウェルに195 μLのブラッドフォード試薬を加え、プレートリーダーで595 nm(A₅₉₅)の吸光度を測定します( 材料表を参照)。
4. 式y = mx + bを使用して、BSA標準曲線と比較して各ウェル内のタンパク質の量を計算します(yはA₅₉₅、xはBSAのμg、mは標準曲線の傾き、bは標準曲線のy切片です)。結果の値に0.05を掛けて、各サンプル中のタンパク質の総mgを決定します。

3. ポリリン酸塩の抽出

1. GITCで溶解した各サンプルに250 μLの95%エタノールを加え、ボルテックスして混合します。
2. その混合物をシリカ膜スピンカラムに適用し、16,100 x g で30秒間遠心分離します。
3. フロースルーを廃棄し、750 μLの5 mM Tris-HCl(pH 7.5)、50 mM NaCl、5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、50%エタノールを加え、16,100 x g で30秒間遠心分離します。
4. フロースルーを廃棄し、16,100 x g で 2 分間遠心分離します。
5. カラムを清潔な1.5 mLマイクロフュージチューブに入れ、150 μLの50 mM Tris-HCl(pH 8)を加えます。
6. 室温で5分間インキュベートし、8,000 x g.
   で2分間遠心分離してpolyPを溶出します注:必要に応じて、溶出液を-20°Cで少なくとも1週間保存できます。

4. ポリリン酸の消化

1. 0、5、50、または 200 μM リン酸カリウムを 50 mM Tris-HCl(pH 8)中で調製します。
   注: リン酸カリウム標準試料は、室温で無期限に保存できます。
2. 各リン酸標準試料と抽出したポリPサンプル100 μLを、透明な96ウェルプレートの別々のウェルに分注します。
3. 30 μLの5x ScPPX反応バッファー(100 mM Tris-HCl、25 mM MgCl₂、250 mM酢酸アンモニウム、pH 7.5)13、19 μLのH₂O、および1 μLの精製ScPPX(1 mg mL-1)を含むマスターミックスを(サンプルあたり)調製します。
4. 50 μLのマスターミックスを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。37°Cで15分間インキュベートします。
   注:必要に応じて、消化したポリPサンプルを-20°Cで無期限に保存できます。

5. 遊離リン酸塩の検出

1. 酒石酸アンチモンカリウム 0.185 g を 200 mL の水に溶解し、150 mL の 4 N H₂SO₄ を加え、次に 1.49 g のヘプタモリブデン酸アンモニウムを加えて検出溶液ベースを調製します。かき混ぜて溶解し、最終容量を456mLにします。溶液をろ過して微粒子を除去し、4°Cで光から保護して最大1か月間保存します。
2. 1Mアスコルビン酸の原液を調製します。4°Cで光から保護して最長1か月間保管してください。
3. 9.12 mLの検出液ベースと0.88 mLの1 Mアスコルビン酸を混合することにより、検出液の新鮮な作業ストックを毎日調製します。使用前に検出溶液を室温に戻してください。
4. 96ウェルプレート内の各サンプルおよび標準試料に50 μLの検出溶液を加え、室温で約2分間インキュベートして発色を可能にします。
5. プレートリーダーで882 nmの吸光度を測定し、リン酸カリウム標準曲線と比較して各サンプルのリン酸塩濃度を計算します。
   注意:検出溶液には有毒な塩と強酸が含まれています。手袋を着用し、余分な溶液を有毒廃棄物として処理してください。

6. 細胞ポリリン酸含有量の計算

1. ステップ5.5で測定したリン酸塩濃度を、次の式に従って、各細胞ライセート全体におけるポリP由来リン酸のナノモルに変換します:
   nmol polyP = 1.5 x (μM リン酸塩 / 10)
   注: ステップ 5 の標準曲線ベースの方法では、ステップ 4.2 で等分された各 100 μL polyP サンプル中のリン酸塩濃度 (μM 単位) を決定します。この濃度をnmolの数に変換するには、100 μLを10⁶で割ってL単位の体積を与え、濃度(μmol ^L-1)を掛けてから、1,000(μmol単位のnmolの数)を掛けます。これは濃度を10で割ることに還元されます。ステップ3で調製した抽出物の総量は150 μLであるため、抽出物全体に存在するリン酸塩のnmolを計算するには、結果の値に1.5を掛ける必要があります。
2. nmol polyPをステップ1.4で決定した各サンプルのmg総タンパク質で除算することにより、細胞polyP含有量を総細胞タンパク質に正規化します。PolyPレベルは、個々のpolyP由来の遊離リン酸の濃度で表されます。
   注:場合によっては、サンプル中に存在するポリP由来のリン酸の量が、リン酸塩標準曲線の線形範囲外になることがあります。polyPのレベルが非常に高い場合は、ステップ3.6の過剰なpolyP含有溶出液を必要に応じて1:10または1:100に希釈し、ステップ4〜6で説明するように再度測定できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
大腸菌 BL21(DE3)	ミリポア シグマ	69450
LB ブロス	Fisher Scientific	BP1427-2	大腸菌増殖培地
アンピシリン	Fisher Scientific	BP176025
塩化ナトリウム (NaCl)	Fisher Scientific	S27110
塩化マグネシウム (MgCl₂)	Fisher Scientific	BP214-500
Bradford 試薬	Bio-Rad	5000205
Tris 緩衝液	Fisher Scientific	BP1525
塩酸 (HCl)	Fisher Scientific	A144-212	トリス緩衝溶液のpH調整用
塩化カリウム(KCl)	ッシャー・サイエンティフィック	P217500
グリセロール	フィッシャー・サイエンティフィック	BP2294
10x MOPS培地混合物	テクノバ	M2101	大腸菌増殖培地
グルコース	フィッシャーサイエンティフィック	D161
一塩基性リン酸カリウム (KH₂PO₄)	フィッシャー サイエンティ	BP362-500
リン酸二塩基性カリウム (K₂HPO₄)	フィッシャー サイエンティフィ	BP363-500
脱水酵母エキス	ッシャー サイエンティ	DF0886-17-0
トリプトン	フィッシャー サイエンティフィ	BP1421-500
硫酸マグネシウム 七水和物	フィッシャーScientific	M63-50
硫酸マンガン一水和物	Fisher Scientific	M113-500
グアニジン イソチオシアネート	Fisher Scientific	BP221-250
ウシ血清アルブミン (プロテアーゼフリー)	Fisher Scientific	BP9703100
透明な平底 96 ウェル プレート	Sigma-Aldrich	M0812-100EA	任意クリアな96ウェルプレートは、
Tecan M1000 Infiniteプレートリーダー	Tecan, Inc.	該当なし	595 nm と 882 nm で吸光度を測定できるプレートリーダーは、
エタノール	Fisher Scientific	04-355-451
シリカ膜スピンカラム	Epoch Life Science	1910-050/250
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)	Fisher Scientific	BP120500
1.5 mL マイクロフュージチューブ	Fisher Scientific	NC9580154
酢酸アンモニウム	フィッシャーサイエンティフィック	A637-500
石酸アンチモンカリウム	フィッシャーサイエンティフィック	AAA1088922
4 N 硫酸 (H₂SO₄)	ッシャーサイエンティフィック	SA818-500
ヘプタモリブデン酸アンモニウム	フィッシャーサイエンティフィック	AAA1376630
アスコルビン酸	ッシャーサイエンティフィ	AC401471000

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