外膜小胞で前処理されたマクロファージにおけるレジオネラニューモフィラ複製のアッセイ

要約

出典: Jung, A. L. et al., Legionella pneumophila 外膜小胞: マクロファージにおける炎症誘発性の分離と分析。J. Vis. 経験。(2017年)

このビデオでは、マクロファージをレジオネラ・ニューモフィラ外膜小胞(OMV)で前処理し、細菌複製に対するマクロファージの効果を調べる様子を紹介します。OMVは、宿主の免疫シグナル伝達を変化させることにより、マクロファージを感染に対してより寛容にします。未処理の細胞と比較して、処理された細胞のコロニー数が高いことは、OMVがマクロファージ内のL.ニューモフィラの複製を促進することを示しています。

プロトコル

1. マクロファージの前処理

1. THP-1(東北病院小児科-1細胞、ヒト単球性白血病細胞株)細胞を調製します.
   注:THP-1は白血病患者由来の単球細胞株です.
   1. 24ウェルあたり2x10 5THP-1細胞を添加し、マクロファージ様細胞に20 nMホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)を添加して分化させます。37°Cで24時間インキュベートします。
   2. 培地を500 μLの新鮮な培地と交換し、さらに24時間インキュベートします。THP-1細胞に最適な培地は、10%子牛胎児血清を添加したRoswell Park Memorial Institute培地(RPMI)1640高グルコースで構成されています。
2. マウス骨髄由来マクロファージ(mBMDM)を単離します。
3. THP-1由来のマクロファージまたはmBMDMを外膜小胞(OMV)で治療します。
   1. OMVを解凍し、タンパク質量(0.1、1、および10 μg/mL)に従ってヒトまたはマウスのマクロファージに追加します。マクロファージをOMVとともに37°Cで少なくとも20時間インキュベートします。

2.マクロファージに感染し、コロニー形成ユニット(CFU)アッセイで細菌複製を評価するレ

1. ジオネラニューモフィラ、ステップ4.3の前処理されたTHP-1細胞またはmBMDMを使用し、前処理されたマクロファージをコントロールとして使用します(2x10⁵/24ウェル)。媒体を交換しないでください。
2. THP-1細胞にL.ニューモフィラCorby WTおよびmBMDMにフラゲリン欠乏変異体に感染させます L.ニューモフィラコービー(どちらも感染多重度(MOI)が0.5;1x10^{5 L}.ニューモフィラ/ 24ウェル)で、それぞれ24時間および48時間インキュベートします。
3. サポニン(最終濃度:0.1%)を添加して培地中の細胞を溶解し、37°Cで5分間インキュベートします。
4. ピペッティングで細菌を再懸濁し、懸濁液を反応容器に移します。L.ニューモフィラ含有培地の連続希釈液を滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で調製します。
5. 緩衝木炭酵母エキス(BCYE)寒天プレート上に必要な希釈液50 μLをストリークし、37°Cで3日間インキュベートします。
6. 形成されたコロニーを視覚的に数えます。CFU

CFUカウントの結果を、100%に設定された前処理されていないが感染したマクロファージに正規化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 cm petridish	Sarstedt AG &; Co KG (Nuembrecht, Germany)	82.1473
活性炭	Carl Roth GmbH &; Co KG (Karlsruhe, Germany)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH& Co KG (カールスルーエ、ドイツ)	5210.2
5% 羊の血を含むコロンビア寒天	Becton Dickinson GmbH (ハイデルベルク、ドイツ)	254005
硝酸第二鉄非水和物	Carl Roth GmbH &; Co KG (カールスルーエ、ドイツ)	5632.1
子牛胎児血清 (FCS)	Life Technologies GmbH (ダルムシュタット、ドイツ)	10270-106
Heracell 240i 二酸化炭素インキュベーター	Thermo Fisher Scientific Germany BV &; Co KG (ブラウンシュヴァイク、ドイツ)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV &; Co KG (ブラウンシュヴァイク、ドイツ)	75004515
接種ループ	Sarstedt AG &; Co KG (Nuembrecht、ドイツ)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---	Antje Flieger 教授 (RKI、ベルリン、ドイツ)
. pneumophila Corby ΔflaA	---	---	Klaus Heuner 教授 (RKI、ベルリン、ドイツ
mBMDM	---	---	Markus Schnare 教授 (フィリップス マールブルク大学、マールブルク、ドイツ) および Carsten Kirschning 教授 (デュイスブルク エッセン大学、エッセン、ドイツ) から親切に提供
PBS	Biochrom GmbH (ドイツ、ベルリン)	L 1825
Phorbol 12-ミリスチン酸 13-アセテート	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (ドイツ、タウフキルヒェン)	P8139-1MG
回転シェーカー (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV &; Co KG (ブラウンシュヴァイク、ドイツ)	SHKE6000
RPMI 1640 高グルコース	Life Technologies GmbH (ダルムシュタット、ドイツ)	11875-093
Saponin	Carl Roth GmbH &; Co KG (カールスルーエ、ドイツ)	9622.1
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (ケンブリッジ、イギリス)	80-2116-30
THP-1	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (タウフキルヒェン、ドイツ)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE	Thermo Fisher Scientific Germany BV &; Co KG (ブラウンシュヴァイク、ドイツ)
酵母エキス	Carl Roth GmbH &; Co KG (カールスルーエ、ドイツ)	2363.2

培地 L) 提供されました、