細菌採取と機械的溶解の手順

要約

出典:Mercier、N.、et al.グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2アフィニティー精製J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、細菌細胞を採取し、それらを機械的に溶解して細胞内内容物を放出する手順を段階

的に示します。

プロトコル

1. 細菌の採取

注意: このステップには病原菌の取り扱いが含まれます。

1. エリスロマイシン(10 μg/μL)を2回添加した3 mLの脳心臓注入(BHI)培地で、pCN51-P3-MS2-sRNAまたはpCN51-P3-MS2プラスミドのいずれかを運ぶ株の1コロニーを増殖させます。
2. エリスロマイシン(10 μg/μL)を添加した新鮮なBHI培地50 mL(≈1/100)で各一晩培養物を希釈し、OD_600nm 0.05 にします。250 mL滅菌フラスコ(フラスコと培地の比率5:1)を使用します。
   注:培地および増殖条件は、研究対象のsRNAの発現パターンに従って設定する必要があります。
3. 培養物を37°Cで180rpmで6時間振とうしながら増殖させます。
4. 各培養物を50 mL遠心分離管に移します。
5. 4°Cで15分間、2,900 x g で遠心分離します。上清を廃棄します。
6. ペレットを氷上に保管し、機械的細胞溶解を直接行うか、ペレットを-80°Cで凍結して保存します。

2. 機械的細胞溶解

注意:以下の手順は氷上で実行する必要があり、バッファーは4°Cでなければなりません。手袋を使用し、サンプルをRNaseから保護するためにあらゆる予防措置を講じてください。

1. ペレット(ステップ1.6)を5 mLのバッファーA(150 mM KCl、20 mM Tris-HCl pH 8、1 mM MgCl₂および1 mM DTT)に再懸濁します。
再
2. 懸濁した細胞を3.5 gのシリカビーズ(0.1 mm)を入れた15 mL遠心分離管に移します。
3. 機械式細胞溶解装置にチューブを挿入します。4.0 m/sで40秒のサイクルを実行します。
   注:1サイクルでは細胞を壊すのに十分でない場合は、サンプルを氷上に置いたままデバイスを5分間冷却します。次に、4.0 m/s で 40 秒のサイクルをもう一度繰り返します。細胞溶解の効率は、BHI寒天プレートに上清をプレーティングすることによってテストできます。
4. 15,700 x g で15分間遠心分離します。上清を回収し、氷上に保持します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL遠心分離管	Falcon	352070
50 mL遠心分離管	Falcon	352051
250 mL培養フラスコ	Dominique Dutscher	2515074	細菌培養
BHI(脳心臓注入)ブロスシ	グマ-アルドリッチ	53286	培地
リスロマイシン(ery)	シグマ-アルドリッチ	フルカ45673	培地
マトリックスBバルク	MP Biomedicals	6540-428	溶解
RNAPro溶液	Biomedicals	6055050	機械的溶解
FastPrepデバイス	Biomedicals	116004500	機械的溶解
分光光度計 Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	細菌培養

成長エ成長溶解機械的MP MP