アフィニティー精製を用いた低分子調節RNA結合細菌標的RNAの単離

要約

出典:Mercier, N., et al.、グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと組み合わせたMS2-Affinity Purification。J. Vis. 経験。 (2021年)

このビデオでは、アミロース樹脂に固定化されたマルトース結合タンパク質(MBP)-MS2コートタンパク質融合によるアフィニティー精製を使用して、細菌の標的RNAに結合したMS2タグ付き低分子調節RNA(sRNA)を単離

する方法を示します。

プロトコル

バッファーと培地

MAPS実験では、以下のバッファーと培地を調製します:- バッファーA(150 mM KCl、20 mM Tris-HCl pH 8、1 mM MgCl₂および1 mM DTT)- バッファーE(250 mM KCl、20 mM Tris-HCl pH 8、12 mMマルトース、0.1%トリトン、1 mM MgCl₂および1 mM DTT)

カラム調製

注意

:アミロース樹脂が乾燥しないように注意してください。必要に応じて、エンドキャップでカラムを密閉します。アフィニティー精製を開始する前に、すべての溶液を準備します。

1. クロマトグラフィーカラムをカラムラックに入れます。
2. カラムチップを取り外し、カラムを超純水で洗浄します。
3. 300 μLのアミロース樹脂を加えます。
4. 10 mLのバッファーAでカラムを洗浄します。
5. MBP(マルトース結合タンパク質)-MS2タンパク質を6 mLのバッファーAで1,200 pmol希釈し、カラムにロードします。
6. 10 mLのバッファーAでカラムを洗浄します。

MS2アフィニティー精製(図1)

1. 細胞ライセートをカラムにロードします。
   注:1 mLの細胞ライセート(粗抽出物、CE)を保持して、トータルRNAを抽出し、ノーザンブロットおよびトランスクリプトーム分析を実行します。
2. フロースルー画分(FT)を清潔な収集チューブに収集します。
3. 10 mLのバッファーAでカラムを3回洗浄し、洗浄画分(W)を回収します。
4. 1 mLのバッファーEでカラムを溶出し、溶出画分(E)を2 mLマイクロチューブに回収します。
5. 収集したすべての画分をRNA抽出まで氷上に保管するか、後で使用するために-20°Cで凍結します。

結果

図 1.黄色ブドウ球菌に適応したMAPSプロトコルの概略図。プラスミド構築からデータ解析まで。

材料