カプセル形成病原性細菌株の培養と単離

要約

出典: Feltwell, T., et.al.不連続密度勾配を用いたカプセル量による細菌の分離J. Vis. 経験。(2019年)

このビデオでは、さまざまなカプセル生産を伴う細菌株の調製と特性評価を示します。カプセル関連遺伝子に異なる変異を持つ病原性株を培養し、液体培地で増殖させ、遠心分離してペレット密度に基づいてカプセルの表現型を区別します。緩衝処理は、カプセル構造を維持しながら細胞を洗浄して安定させるために使用されます。

プロトコル

1. 細菌株または変異体ライブラリーの調製

1.適切な寒天プレートでテストする菌株をストレートアウトします。これらは実験用のストックプレートです。

1. プレートを所望の温度で一晩インキュベートして、単一のコロニーを実現します。この実験では、肺炎菌(NTUH-K2044およびATCC43816株)をルリアブロス(LB)寒天培地で37°Cで培養し、肺炎球菌(23F野生型および23FΔcps)を37°Cの加湿キャンドルジャー内の血液寒天培地で培養します。

2. ストックプレートから単一のコロニーを選択し(ステップ1.1)、滅菌ループまたはカクテルスティックを使用して10 mLの適切なブロスを接種します。ランダム変異体ライブラリーのスクリーニングには、10 μLのランダム変異体ライブラリーストック(TraDISライブラリー)をブロスに接種します。

1. 肺炎菌株を37°Cの低塩LB培地で振とうしながらインキュベートし、肺炎球菌株を脳心臓注入(BHI)培地で37°Cで静的にインキュベートします。

2. 一晩培養物を15 mLチューブに移し、ベンチトップ遠心分離機で3,200 x gで10分間遠心分離し、15 mLチューブインサートとエアゾールタイト蓋を備えたスイングアウトバケットに入れます。

3. 上清を廃棄し、ペレットを2 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。

注:実験室で適切な液体生物学的廃棄物経路を介して上清を廃棄してください。遠心分離および再懸濁ステップ(1.2.2および1.2.3)の目的は、グラジエント上で簡単に視覚化できるように細菌を濃縮することです。細菌培養物は、必要に応じてグラジエントに直接ロードできます。重度にカプセル化された株は、タイトなペレットを形成しない場合があります。これが発生した場合は、細菌細胞を除去せずにできるだけ多くの上清を除去し、1x PBSを最終容量5mLまで添加し、ペレットを再懸濁します。手順 1.2.5 でプロトコルを続行します。

5. 手順1.2.2で説明したようにチューブを遠心分離します。

6. 上清を廃棄し、ペレットを2 mLの1x PBSに再懸濁します。これで、細胞を使用する準備が整いました。

注:細菌細胞懸濁液の密度はcritica,lではありませんが、勾配での視覚化には十分である必要があります。最小OD₆₀₀(600nmでの光学密度)は4が推奨されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ローターA-4-81および500 mLバケット付き遠心分離機5810R	Eppendorf	5810 718.007
15 mLチューブ用アダプター	Eppendorf	5810 722.004
固定式ローター F-34-6-38	Eppendorf	5804727.002
2.6〜7 mLチューブアダプター	Eppendorf	5804 739.000
ローターFA-45-24-11を含む遠心分離機5424	Eppendorf	5424 000.460
2 mLチューブ	Eppendorf	0030 120.094
1.5 mLチューブ	Eppendorf	0030 120.086
P1000ピペットとチップ
P200ピペットとチップ