不連続密度勾配を用いたカプセル量による細菌の分離

要約

出典: Feltwell, T., et.al.不連続密度勾配を用いたカプセル量による細菌の分離J. Vis. 経験。(2019年)

このビデオでは、カプセル量に基づいて細菌株を分離するための不連続密度勾配の使用を示しています。トランスポゾン変異体ライブラリーを勾配を通して遠心分離することにより、異なるカプセル密度を持つ細菌は異なる層に局在します。分離された画分は、下流の分析のために収集できます。

プロトコル

1. 調製した細胞をグラジエントに加え、遠心分離による分離

調

1. 製した細胞600 μLを、界面を混合せずにチューブ内のグラジエントの上部に非常にゆっくりと加えます。
2. チューブをチューブアダプターに入れ、組み合わせたアダプターとチューブの重量を量ってバランスが取れていることを確認します。
   1. チューブアダプターをベンチトップ遠心分離機内の固定角度ローターに配置します。3,000 x g で 30 分間遠心分離します。
   2. 遠心分離後、チューブを慎重に取り外し、適切なラックに置き、結果を記録として写真に収めます。
3. ウロン酸定量またはDNA抽出のために細菌画分を回収します。
   1. 下流のアプリケーションが必要ない場合は、実験室で適切な液体生物学的廃棄物経路を介してサンプル/グラジエントを廃棄してください。
      注:細菌の新しい種/株の分離を検証することが重要です。勾配からの個々の画分は、顕微鏡検査、ウロン酸アッセイ、または別の適切な定量アッセイによって検査して、各画分のカプセル表現型を確認する必要があります。凝集または細胞サイズに基づいて分離することが目的である場合は、独立した適切なアッセイを使用する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500ml buckets	Eppendorf	5810 718.007
Adapters for 15 ml tubes	Eppendorf	5810 722.004
固定角ローター F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
2.6 - 7 ml チューブアダプター	Eppendorf	5804 739.000
ローター FA-45-24-11	Eppendorf	5424 000.460
5 ml ポリプロピレン丸底チューブ	Falcon	352063