グラム陰性菌のマイクロ流体分離のためのアプタマー支援音響泳動

要約

出典: Choi, H. J., et al.アプタマアフィニティービーズを用いたグラム陰性菌のフロースルー分離のためのマイクロ流体音響泳動J. Vis. 経験。 (2022年)

このビデオでは、アプタマーでコーティングされたマイクロビーズとマイクロ流体チップ内の音響力を使用して、混合細菌サンプルからグラム陰性菌を選択的に分離する方法を示します。

プロトコル

1. 音響導入のセットアップと操作
   1. ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブを、2つのサンプルとバッファーを注入するための2つの入口と、廃棄物を収集および排出するための2つの出口に接続します(図1)。
   2. 10 mLのシリンジを使用して、マイクロ流体音響泳動チャネルに気泡のない脱塩水を手動で満たします。
   3. 流体の流れを制御するために、2つ以上の出力チャネルを備えた精密圧力コントローラーを準備します。次に、バイアルにそれぞれサンプルとバッファーを半分充填し、キャップに2つの穴を開け、チップインレットに接続します。
      注:2つ以上の出力チャネルを備えた精密圧力コントローラーは、複数の精密圧力コントローラーに置き換えることができます。バッファー入口では、サンプル注入中にサンプルが中心に移動するのを防ぐ層流を生成できるバッファーがフローコントローラーを介して注入されます。
   4. 装置を準備した後、精密圧力制御装置を使用して、サンプル入口に2 kPa、バッファー入口に4 kPaの圧力を加えて、サンプルとバッファーを注入します。
      注:このとき、スムーズな層流のためには、バッファーの注入圧力をサンプルの注入圧力よりも高くする必要があります。流量は、入口チャネルに接続された吸引器に固定されたフローコントローラーによって制御されます。
   5. 圧電トランスデューサ(PZT)を使用してビードに焦点を合わせ、顕微鏡で確認しながらビードをマイクロ流体チャネルの中心に移動します。
      注:ビーズが大きいほど、波形への影響が大きくなるため、ノードポイントに合わせやすくなります。アンプを備えたファンクションジェネレータは、PZTに電力を印加して、マイクロチャネルに正弦波を生成します。マイクロチャネルの上部と下部はガラスでできているため、発生した正弦波が反射してノードポイントが形成されます。
   6. シングルチャネルファンクションジェネレータを使用して、3.66MHzの共振周波数を生成し、パワーアンプを使用して標準信号を16dB(約9倍)増幅します(図1)。
      注:アクチュエータの共振周波数は、チャネルが正方形であるため、チャネルのサイズと一致する必要があり、PZTは正確な周波数で動作して単一ノードを作成します。
   蛍
   7. 光顕微鏡と1,200fps(フレーム/秒)で動作する高速カメラを使用して、音響流体チップ上の分離と濃縮プロセスを観察します。
   8. 蛍光顕微鏡カメラで撮影した細菌結合ビーズと、収集および廃棄物出口サンプルから排出される細菌の画像を確認することにより、グラム陰性菌(GN)菌およびグラム陽性菌(GP)菌の有無を定量化および分析します。
      注:バッファー、バクテリア、およびアプタマーを含むマイクロビーズはメインチャネルを通過し、マイクロビーズはPZTによって誘導されるチップ内音響泳動を介して中央に整列されます。最後に、GN菌と結合したマイクロビーズを採取口に集め、回収されなかった菌は廃棄物口から排出されます。

結果

図1:細胞の分離と収集に使用される音響流体システムの概略図。サンプルまたは緩衝液は、フローコントローラーを介して入口ポートに注入されます。ビーズのセンタリングとサンプル分離のために、パワーアンプを備えたファンクションジェネレータを介して AC 電源が PZT に印加され、マイクロチャネルに音響放射力が生成されます。分離された対象サンプルは収集チューブから収集され、残りの廃液は別の出口から回収されます。高速カメラモジュールを使用して分離を視覚化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 μm ストレプトアビジンコーティングマイクロビーズ	Bang Laboratories	CP01007	アプタマーアフィニティービーズ
Aptamer	Integrated DNA Technologies	GN3-6'	細菌結合用RNA
腸菌DH5α	KCTC	KCTC2571	標的細菌
機能発生器	GW Instek	AFG-2225	周波数生成
高速度カメラ	Photron	FASTCAM Mini	分離観察
KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe	Koreavaccine	22G-10ML	マイクロ流体音響泳動チャネルに気泡のない脱塩水を充填します。
顕微鏡	オリンパス株式会社	IX-81
PEEKチューブ	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	粒子の注入または収集
電トランスデューサ	Fuji Ceramics	C-213	チャネル内の特定の波を生成する
パワーアンプ	Amplifier Research	75A250A	周波数増幅
圧力コントローラー/μflucon	AMED AMED-μflucon	空気圧/流量コントローラーの制御

大の分離観察 圧