細菌の生物発光と細胞密度を相関させる in vivo アッセイ

要約

出典: Brodl, E., et al.生物発光細菌の細胞密度と発光のその場測定と相関J. Vis. 経験。(2018)。

このビデオは、形質転換細菌の生物発光と細胞密度の測定と相関関係を示しています。単一の細菌コロニーを使用して液体培養を開始します。培養物は、所望の細胞濃度のウェルに入れられます。抗生物質と誘導剤を添加して、細菌の生物発光に必要な遺伝子を発現します。吸光度と生物発光の読み取りは、プレートリーダーを使用して一定の間隔で取得されます。

プロトコル

1. 大腸菌におけるルクスオペロンの設計、調製、発現

注

:このセクションで使用される市販キットについては、 材料表を参照してください。

1. ルクスオペロンを大腸菌に移すには、適切な制限部位と目的の抗生物質耐性遺伝子(pET28a;NcoI、XhoI、カナマイシン)。
2. Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2) の DNA 配列に基づいて、ギブソン アセンブリ用のフラグメントと重なり合うプライマーを設計します。
3. 設計されたプライマーとPhotobacterium mandapamensis 27561の単離されたゲノムDNA(デオキシリボ核酸)をテンプレートとして、標準的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応を設定します。
   注:それぞれの細菌株のゲノムDNAを単離すると、PCRの有効性が向上します。
4. スピンカラム精製によりPCR産物を精製します。
5. 単離したpET28aベクターをNcoIおよびXhoIで37°Cで45分間制限消化します。
6. 線形化したベクターとPCRフラグメントを、アガロースゲル電気泳動とそれに続くスピンカラム精製によって精製します。
7. 各フラグメントと線形化ベクターのDNA濃度を決定し、プロトコルに従ってアセンブリに最適な量を計算します。
   注:アセンブリの有効性はフラグメントのサイズと数に依存し、メーカーのプロトコルに従って調整する必要があります。
8. すべてのフラグメントとバッファーをPCRチューブで結合した後、アセンブリ混合物をPCR装置で50°Cで1時間インキュベートします。
9. 大腸菌のプラスミド形質転換のための標準的な形質転換プロトコルに従って、組み立てられたベクター産物を、高収率プラスミド複製のための適切な大腸菌システム(例:大腸菌TOP10またはXL-1)に変換します。
10. 形質転換プレートからコロニーをピックし、DNA単離のために新しいプレートに縞を描きます。
11. 標準プロトコルに従ってプラスミドDNAを単離します。
12. すべてのフラグメントを含むプラスミドの正しいアセンブリを検証するには、まず、アセンブリされたすべてのフラグメントに固有のプライマーを使用して、標準プロトコルに従ってコロニーPCRを実行します。
13. コロニーPCRおよびその後のアガロースゲル電気泳動に加えて、DNAシーケンシング用に単離されたすべてのアセンブリベクターを調製して、正しいアセンブリと正しいDNA配列を検証します。
検証
14. 済みのプラスミドを、大腸菌の細菌プラスミド形質転換の標準形質転換プロトコルに従って、高収率タンパク質生産のための適切な大腸菌システム(例:大腸菌BL21)に変換します。
    注:以下の発現プロトコルを直接続行します。長期保存の場合は、グリセロールストックの調製をお勧めします。

2. 修飾大腸菌株の発現

1. 適切な量のルリア-ベルタニ(LB)培地(例:100 mL)に、組み立てられたプラスミドで形質転換した大腸菌BL21細胞の事前に調製したグリセロールストックを接種するか、形質転換プレートから直接接種することにより、発現用のオーバーナイト培養(ONC)を調製します。100 μLのカナマイシン(50 mg / mL、pET28aの抗生物質耐性遺伝子)を加え、ONCをインキュベーターシェーカーで37°Cおよび120 rpmで一晩インキュベートします。
2. 主発現培養物(例:800 mLのLB培地)に8 mLのONCを接種し、800 μLのカナマイシン(50 mg/mL)を加えます。
3. 細胞密度が0.6〜0.8(約2.5時間)のOD₆₀₀に達するまで、インキュベーターシェーカーでメイン培養物を37°Cおよび120rpmでインキュベー
トします。
4. インキュベーション温度を28°Cに下げます。
5. プロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度0.1 mMに添加することによりタンパク質発現を誘導します。
   注:実証試験では、温度を28°Cに下げると、最高の光強度が得られることが示されました。
6. 細胞が輝き始めるまで(約1時間)観察します。
   注:発現の目的に応じて、細胞を翌日まで増殖させてから採取するか、細胞が輝いている限り(最大48時間)振とう続けることができます。細胞の採取とタンパク質の精製は、標準的な手順に従って行うことができます。

3. 細菌生物発光株の発現

注

: 細菌生物発光株は、成長と光生産のために特定の増殖培地/人工海水培地を必要とします。

1. 別々に調製された2つの培地成分で構成される人工海水培地を調製します。 />注:次の量は、1 Lの液体培地または1 Lの寒天培地用です。
   1. 人工海水培地の場合、次の塩で計量します:28.13 g NaCl(塩化ナトリウム)、0.77 g KCl(塩化カリウム)、1.60 g CaCl₂・2H₂O(塩化カルシウム二水和物)、4.80 g MgCl₂・6H₂O(塩化マグネシウム六水和物)、0.11 g NaHCO₃(重炭酸ナトリウム)、および3.50 g MgSO₄・7H₂O(硫酸マグネシウム七水和物)。
   蒸
   2. 留水1Lを加え、すべての成分を溶かします。
   3. LB培地の場合は、酵母抽出物10 g、ペプトン10 g、寒天プレートの場合は寒天20 g
   の成分を計量します。
   4. 水道水250mLを加え、成分を溶かします。
   5. 調製した両方の培地を別々に121°Cで20分間オートクレーブします。
   6. 寒天プレートの場合は、オートクレーブ滅菌直後に250 mLのLB培地と750 mLの人工海水培地を混合し、プレートを調製します。
   7. 液体培地の場合、オートクレーブ滅菌直後または冷却時に、250 mLのLB培地と750 mLの人工海水培地を混合します。
      注:人工海水培地は、塩の沈殿によって濁る場合があります。
2. 人工海水培地寒天プレート上で細菌生物発光株を縞模様にし、24〜30°Cで一晩インキュベートします。
   注:細菌株の長期保存は、通常、細菌培養物のグリセロールストックを凍結することによって達成されます。解凍後の成長に遅れがあるため、液体培養に使用する前に、すべての株の均一な開始条件を保証するために、株は常に最初に寒天プレートに縞模様を描く必要があります。
3. 100 mLの人工海水培地にプレートからの単一のコロニーを接種することにより、ONCを調製します。ONCを24〜30°Cおよび120rpmでインキュベーターシェーカーで一晩インキュベートします。
4. 800 mLの人工海水培地に8 mLのONCを接種します。
5. インキュベーターシェーカーで細菌細胞を24〜30°Cおよび120rpmでインキュベートします。
   注:生物発光細菌の光強度プロファイルは、温度によって大きく変化します。それぞれの細菌株の光産生の調節メカニズムに応じて、発光は約1〜6時間後に開始されることがあります。
6. 細菌の細胞培養が輝き始めるまで観察します(約1〜6時間)。
   注:発現の目的に応じて、細胞を翌日まで増殖させてから採取するか、細胞が輝いている限り振とう続けることができます。細胞の採取とタンパク質の精製は、標準的な手順に従って行うことができます。

4. 細菌生物発光株および修飾大腸菌株の生体内活性アッセイ

注

:株の長期保存は通常、細菌培養のグリセロールストックを凍結することによって達成されます。解凍後の成長に遅れがあるため、液体培養に使用する前に、すべての株の均一な開始条件を保証するために、株は常に最初に寒天プレートに縞模様を描く必要があります。

1. 目的の生物発光細菌株または修飾大腸菌株を寒天プレート上にストリークし、28°Cで一晩インキュベートします。
   注:インキュベーション温度は株ごとに異なる場合があり、経験的に評価する必要があります。生物発光細菌株と改変大腸菌株を比較できるようにするには、増殖条件が同一でなければなりません。
2. 寒天プレートからの単一のコロニーでそれぞれの株を3 mLの培地に接種し、インキュベーターシェーカーで28°Cおよび180 rpmで細胞を約1〜2時間インキュベートします。
3. 650 nmで液体培養物の1:10希釈液の細胞密度を測定します。OD650が0.05.
   注:その後のプレートリーダーアッセイでは、株の発光による干渉を避けるために、650 nmでの細胞密度を決定します。
4. 計算された培養量と培地を、ガラス底の24ウェル黒壁プレートにピペットで入れます。修飾大腸菌株の場合、1 μLのカナマイシン(pET28aベクターの抗生物質耐性)と1 μLのIPTG(遺伝子発現の誘導)をサンプルに加えます。測定中の蒸発を避けるために、プレートに蓋をします。
   注:ルクスオペロン全体を含むpET28aベクターが大腸菌培養によって失われないようにするには、プレートウェル内の各大腸菌サンプルにカナマイシンを添加し、大腸菌細胞の光産生を測定できることを保証する必要があります。 遺伝子発現はIPTGによって誘導されなければなりません。クロストークや測定の干渉を避けるために、ガラス底と透明な蓋を備えた黒壁ウェルプレートが最良の結果を示しました。それにもかかわらず、クロストークが観察される可能性があり、井戸の位置は慎重に選択する必要があります。
5. プレートリーダーで測定を開始します。
   注:プレートリーダープロトコルは、吸光度と生物発光の2つの測定を組み合わせた、このアッセイ用に特別に開発されたスクリプトに基づいています。データポイントは10分ごとに収集され、測定と28°Cの一定温度の間に恒久的な振とうがあります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit	New England Biolabs Inc.	E2621S	for 10
rxndx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad Phusion Polymerase	Thermo Scientific	F530S
Q5 High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs Inc.	M0491S
GeneJet ゲノム DNA プリフィフケーション キット	Thermo Scientific	K0721	50 rxn
制限酵素およびバッファー用 (NcoI、XhoI)New	England Biolabs Inc.	R3193S/R0146S
Wizard SV ゲルおよび PCR クリーンアップ キット	Promega	A9282	for 250 rxn
Monarch DNA ゲル抽出キット	New England Biolabs Inc.	50 rxn 用	#T1020S
GeneJet プラスミド ミニプレップキット	Thermo Scientific	K0503	250 rxn 用
GoTaq G2 DNA ポリメラーゼ	Promega	M7841
24 ウェルブラックセンサレート、ガラス底付き	Greiner Bio One	662892
FLUOStar Omega プレートリーダー	BMG Labtech
OPTIMA/Mars Analysisソフトウェア	BMG Labtech		バージョン 2.20
Microsoft Excel 2010	Microsoft
Multitron Standard Incubator Shaker	Infors AG