グラム陽性菌の抗生物質感受性試験のためのブロス微量希釈法

要約

出典: Koeth, LM, et al., A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin in vitro 好気性増殖細菌の感受性試験。J. Vis. 経験。(2015年)。

このビデオでは、グラム陽性菌に対するリポグリコペプチド抗生物質の最小阻害濃度(MIC)を決定するためのブロス微量希釈法を示します。細菌コロニーの単離、希釈、抗生物質濃度の異なるマイクロプレートウェルの接種、培養純度と細胞数の検証について説明します。このビデオでは、抗生物質の結合が細胞壁合成を妨害し、溶解を引き起こす方法と、目に見える増殖阻害に基づいてMICを特定する方法についても説明しています。

プロトコル

1. MICパネル希釈液の調製滅

1. 菌ガラスまたはプラスチックチューブに純(純粋)ジメチルスルホキシド(DMSO)で1,600 μg/mL以下のダルババンシンストック溶液を調製し、調製の同じ日に使用するか、-20〜-60°C以下で保存して、霜取りをしない冷凍庫で将来使用します。粉末の重量を量るときは、粉末と一緒に受け取った文書に記載されているダルババンシンの効力を考慮してください。
滅
2. 菌ガラスまたはプラスチックチューブにきちんとしたDMSOを使用したスキームと同様に、ストック希釈液を希釈します。希釈液の測定には1つのピペットを使用し、最初のダルババンシンストックを最初のチューブに加えるには別のピペットを使用します。その後のダルババンシンストック濃度ごとに、新しいピペットを使用します。
3. 100倍の最終MICパネル濃度希釈液(中間濃度)を純DMSOで調製します。適切な量のソースとDMSOを組み合わせて、所望の中間濃度を達成します(使用する量は、作成するMICパネルの数によって異なります)。
4. 0.004%P80の調製:0.1 mL P80を4.9 mL dH₂Oに加えて、2%P80の新鮮な作業原液を調製します。0.22 μmフィルターを通して滅菌し、調製当日に溶液を使用します。2%P80を1:500に希釈して、0.004%P80希釈液を調製します(たとえば、0.3 mLの2%P80から149.7 mLのCAMHB)。
5. さらに、接種物を添加すると1:2希釈になるため、0.004%(v / v)ポリソルベート-80(P-80)および/またはLHB(連鎖球菌用)を添加した陽イオン調整ミューラーヒントンブロス(CAMHB)で中間濃度を1:100に希釈します。

2. MICパネルを調製する調製した

1. 各ダルババンシン溶液50 μLをMICパネルの適切なウェルに分注し、培地を1つのウェル(増殖対照ウェル)にのみ含めます。このステップには、滅菌チップ付きのマルチチャンネルピペットを使用できます。
2. パネルをすぐに使用するか、プラスチックフィルムで密封し、ビニール袋に入れ、必要に応じてすぐに≤-20°C(できれば≤-60°C)の霜取りなし冷凍庫に入れます。凍結パネルを使用する場合は、シールを取り外し、個々のパネルを実験台に15〜30分間(ウェル内容物が解凍されるまで)置き、パネル接種に進みます。

3. MICパネルを接種し、純度を測定し、コロニー数を設定する

1. 18〜24時間の血液寒天培地または他の非選択的寒天プレートから、十分に単離されたコロニーをいくつか選択します。滅菌ループまたは綿棒で各コロニーの上部に触れ、濁度が0.5マクファーランド標準と同等になるまで1〜5 mLのCAMHBまたは生理食塩水に移します。濁度を 0.5 McFarland と視覚的に比較するか、測光装置を使用して
評価します。
2. 調製から15〜30分以内に、接種物をCAMHBで1:100に希釈します(100 μLを10 mL CAMHBに)。肺炎球菌を除くダルババンシンに対して試験されたほとんどの細菌では、この希釈により、最終ウェル濃度は5×10⁵CFU/mLになります(許容範囲は2〜8×10⁵CFU/mLです)。肺炎球菌の場合、濁度と0.5マクファーランドの比較に基づく細菌濃度は、通常かなり低くなります。したがって、接種物を1:25に希釈します(400 μLを10 mL CAMHB + 10%LHBに)。
3. 接種物の調製後15分以内に、50 μLの最終接種物を調製したMICパネルの各ウェル(無菌対照ウェルを除く)に移します。このステップには、滅菌チップを使用したマルチチャンネルピペットを使用できます。
滅
4. 菌ループを使用して、1〜10 μLのアリコートを陽性増殖対照ウェルから非選択的寒天(例えば、5%羊の血液を含むトリプチカーゼ大豆寒天培地)に移し、広げることにより、純度チェックを実行します。
5. シングルチャンネルピペットと滅菌チップで増殖対照ウェルから10 μLを除去し、10 mLの生理食塩水(1:1,000希釈)に移すことにより、コロニーカウントを設定します。100 μLをシングルチャンネルピペットと滅菌チップで混合して、適切な非選択的寒天培地(例えば、5%羊の血液を含むトリプチカーゼ大豆寒天培地)に移し、滅菌ループで寒天表面全体に広げ、接種物の均一な分布を保証するために異なる方向に2回繰り返します(1:10希釈

)。

4. MICパネル、コロニーカウント、純度プレートをインキュベート

するインキュベーション

1. する前に、各MICパネルまたは4枚以下のパネルのスタックをビニール袋にプラスチックテープまたはぴったりとフィットするプラスチックカバーで密封します。または、空の MIC パネルを 4 枚以下の MIC パネルのスタックの上部に置き、湿らせたペーパータオルをプラスチック容器に入れ、MIC パネルをプラスチック容器に入れ、容器を蓋でしっかりと閉じます。MICパネルを35°C±2°Cの周囲空気インキュベーターで16〜20時間(ブドウ球菌および腸球菌)および20〜24時間(連鎖球菌)を接種後30分以内にインキュベートします。コロニーカウントプレートと純度プレートを同じ条件下でインキュベートしますが、連鎖球菌を5%CO₂インキュベーターでインキュベートします。

5. MICおよびコロニーカウントプレートを読み取ります。純度プレートのチェック

1. 肉眼で検出されたウェル内の細菌の増殖を完全に阻害する最低濃度としてMICを読み取ります。
2. コロニーカウントプレートのコロニーをカウントします。各コロニーに希釈係数(1:10,000)を掛けます(たとえば、50コロニーは5×10⁵CFU / mLに相当します)。許容範囲は20〜80コロニー(2〜8×10⁵CFU/mL)であり、おおよそのガイドラインとして使用されます。
3. 純度プレートを確認してください。すべてのコロニーが各コロニーに類似している場合、接種物は純粋であると見なすことができます。他のコロニーが存在する場合は、MICパネルに汚染物質が存在する可能性があるため、テストを繰り返す必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルババンシン	・メトリックス株式会社	ノースカロライナ州グリーンビル	BI-397
バンコマイシン	シグマ アルドリッチ	ズーリ州セントルイス	C5793
陽イオン調整ミューラー ヒントン ブロス	ベクトン ディキンソン	スパークス、メリーランド州	212322
溶解馬の血液	ハイオ州		リーブランド サイエンティフィック
Dose-it 蠕動ポンプ	インテグラ バイオサイエンス	ハンプシャー州
マルチチャネルピペット (Viaflo II)	Integra	Hudson, NH	4164
12チャンネルピペット (Matrix)	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
Single channelpPipet (Ovation 10 μL - 100 μL)	VistaLab	Brewster, NY
96ウェルマイクロプレート	Greiner Bio-one	Monroe, NC	650161
50 mLフラットキャップコニカルボトム遠心チューブ	ThermoFisher Scientific	ウォルサム、マサチューセッツ州
16x125mm 使い捨てガラス管	ThermoFisher Scientific	ウォルサム、マサチューセッツ州
12x17mm スナップキャップ、ポリスチレンチューブ	ThermoFisher Scientific	ウォルサム、マサチューセッツ州
16 mL 遠心分離管	BioExpress	Kaysville, UT	C-3394-2
試薬リザーバー	Integra Biosciences	Hudson, NH	4312
使い捨て滅菌ループ (1 μL &; 10 μL)	Biologix	Lenexa, KA	65-0001,65-0010
トリプシン大豆寒天培地 + 5% 羊の血液	Becton Dickinson	Sparks, MD
インキュベーター (常温)	Sanyo
インキュベーター (5% CO₂)	Sanyo
分析天びびん	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
袋	Kimberly-Clark		52817
白衣

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