細菌感染細胞におけるエンドリソソームリモデリングのナノ粒子媒介可視化

要約

出典: Zhang, Y., et al.細胞内細菌によるエンドリソソーム系のリモデリング研究への蛍光ナノ粒子の応用J. Vis. 経験。(2015年)

このビデオでは、細胞内細菌に感染したヒト上皮細胞におけるエンドリソソームリモデリングを視覚化するための蛍光ナノ粒子の使用を示しています。細菌の侵入後、病原体は宿主の細胞骨格とエンドリソソーム系を操作し、小胞輸送を変化させる管状突起を持つ液胞を形成します。次に、蛍光標識ナノ粒子を使用してこれらの変化を追跡し、病原体誘発性細胞内輸送イベントの高解像度イメージングを可能にします。

プロトコル

1. HeLa細胞の培養
   1. LAMP1-GFP(リソソーム関連膜糖タンパク質1-緑色蛍光タンパク質)を永久に発現するHeLa細胞を、10%子牛胎児血清(FCS)を含むダルベッコの修飾イーグル培地またはDMEMで培養し、5%CO₂を含む雰囲気中で37°Cで増殖させます。
   2. 8ウェルチャンバースライド(Ibidi)にウェルあたり50,000の密度で細胞を播種し、一晩インキュベートします(O / N)。
2. 細菌の培養
   1. サルモネラ菌血清型チフス菌 NCTC 12023 野生型 (WT) 株を使用します。比較のために、SPI2-T3SSに欠陥のある変異株ΔssaVと、SIFにキーエフェクターSifAを欠くΔsifAを使用します。増強されたGFPの構成的発現のためにプラスミドpFPV25.1を含有する株を使用します。
      注:細菌株は、プラスミドを維持するために必要な50 μg/mlのカルベニシリン(WT)および/または50 μg/mlのカナマイシン(ΔssaV、ΔsifA)を添加したLBを添加して、Luria-Bertaniブロス(LB)で日常的に培養されます。
   2. 3 ml LB中の細菌の単一コロニーに適切な抗生物質を接種し、曝気のために振とう条件下で37°CでO / Nを増殖させ、次に新鮮なLBで1:31に希釈し、3.5時間増殖を続けます。この時点で、培養物は後期対数期に達し、細菌は非常に侵襲的です。「ローラードラム」は、曝気で試験管培養物をインキュベートするのに便利です。
3. サルモネラ菌および金-BSA-ローダミンナノ粒子またはNPsパルスチェイス標識によるHeLa細胞の感染(スキームについては図1を参照)
   1. 継代培養細菌のOD₆₀₀を測定し、1 mlのリン酸緩衝生理食塩水またはPBS(~3 × 10⁸ cfu/ml)、8ウェルチャンバースライドのHeLa細胞に適切な量の細菌を添加して、100の感染多重度(MOI)を達成します。
   2. 細胞インキュベーターで30分間インキュベートし、PBSで3回洗浄して、内在化されていない細菌を除去します(この時点は感染後0時間、または0時間p.i.として設定されました)。100 μg/mlのゲンタマイシンを含む300 μlの新鮮な培地を加え、1時間維持します。次に、残りのインキュベーション時間の間、培地を10μg/mlのゲンタマイシンを含む新鮮な培地と交換します。
   3. 100 μg/mlのゲンタマイシンを含む培地と1時間インキュベートした後、培地を10 μg/mlのゲンタマイシンを含むイメージング培地(FCS、L-グルタミン、フェノールレッド、重炭酸ナトリウムを含まないイーグルのMEM、30 mM HEPES、pH 7.4)に置き換えます。金-BSA-ローダミンNPをHeLa細胞に添加して、OD₅₂₀ = 0.1の最終濃度を得る。(ウシ血清アルブミン、またはBSA)
      注:金-BSA-ローダミンNPは、感染前、またはさまざまな時点で細胞に添加することもできます。
   4. 1時間のインキュベーション後、培地を取り出し、PBSで3回洗浄し、残りのインキュベーション時間の間、10%FCSと10μg/mlのゲンタマイシンを含む300μlの新鮮なイメージング培地を加えます。
      注:インキュベーションの期間は、使用するNPおよび細胞株の濃度によって異なる場合があります。RAW264.7マクロファージの場合、OD₅₂₀ = 0.05の濃度でNPと30分間インキュベートすると、十分な内在化が可能になることが観察されました。

結果

図 1.生細胞イメージングのためのHeLa細胞の作製のためのスキームHeLa細胞をチャンバースライドに播種し、模擬感染させるか、またはさまざまなサルモネラ菌株に30分間感染させ、PBSで3回洗浄し、100 μg/mlのゲンタマイシンを含む培地と1時間インキュベートした。続いて、培地を10 nmの金-BSA-ローダミンNP(OD₅₂₀ = 0.1)および10 μg/mlのゲンタマイシンを含むイメージング培地に置き換え、1時間インキュベートした後、...

材料