鉄制限条件下での結核菌の培養

要約

出典: Gupta、S.、 et al。鉄制限性抗酸菌により産生される細胞外小胞の単離と特性化 J. Vis. 経験。 (2019年)

このビデオでは、結 核菌 を鉄制限条件下で培養して、鉄ストレスを誘発し、細菌の生存をサポートするシデロフォアの分泌を促進する手順を示します。

プロトコル

1. 鉄分が制限された状態でのマイコバクテリアの増殖

1. Mtb(結核菌 )の凍結15%グリセロールストック50 μLを解凍し、10%ADN(アルブミン - デキストロース - NaCl)濃縮(5 g/Lアルブミン、2 g/Lデキストロース、および0.85 g / L塩化ナトリウム、0.2%グリセロール、および0.05%トゥイーン-80)を添加した寒天プレートを縞模様にします。コロニーが見えるまでプレートを37°Cでインキュベートします。
2. ADN濃縮を添加した2 mLの抗酸菌ブロス培地(材料表)にMtbの単一コロニーを接種します。37°Cで撹拌しながらインキュベートします。
3. Mtb培養物を後期対数期まで成長させます(OD₅₄₀ は~0.8)。これを確認するには、分光光度計を使用してOD₅₄₀ を測定します。
4. 200 μLの後期対数培養物を、0.2%グリセロール、0.05%トゥイーン-80、およびADNを添加した抗酸菌寒天プレート(材料表)に広げます。少なくとも5枚のプレートを接種します。細菌の増殖がコンフルエント層として見えるまで、プレートを37°Cでインキュベートします。Mtbの場合は~1週間かかります。
5. 滅菌綿棒をLIMM(低鉄ミニマルミディアム)で濡らします。この綿棒を使用して寒天プレートから細菌を収集し、100 mLのLIMMを接種して、OD₅₄₀ が~1.0の濃縮細菌懸濁液を調製します。
6. この懸濁液をLIMMで10倍に希釈して1 Lにし、それぞれに500 mLの培養物を入れた2つの2 L滅菌ペットボトルに分けます。
7. 培養物2mLを取り出し、5mL培養チューブに移します。10 μLの10%vol/volチロキサポールを加えます。
8. 培養物を37°Cで14日間インキュベートします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ミドルブルック 7H10 寒天	BDディフコ	262710	抗酸菌寒天プレート
ミドルブルック 7H9 ブロス	BDディフコ	271310	マイコバクテリアブロス培地
ポリプロピレン薄肉遠心分離管 13x15 mm	ベックマン・コールター	344059	ポリプロピレン薄肉遠心分離管 13x15 mm
真空ろ過フラスコ	セルプロ	V50022	フィルターユニット