結核菌からのシデロフォア含有細胞外小胞の単離

要約

出典: Gupta、S.、Marcela Rodriguez、G.鉄限定抗酸菌によって産生される細胞外小胞の単離と特性評価。 J. Vis. 経験。 (2019年)

このビデオは、宿主環境を模倣した鉄制限条件下で培養された 結核菌 からの細胞外小胞(EV)の段階的な単離を示しています。EV 含有画分を濃縮および同定するための限外濾過、分画遠心分離、および密度勾配分離の使用について概説します。

プロトコル

1. マイコバクテリア細胞外小胞(MEV)の収集

1. 収集時に2 mL培養物のOD₅₄₀ を測定します。培養物を1:10に連続希釈し、ADNと0.05%Tween-80を含む寒天プレートに各希釈液100 μLをプレートします。
2. 培養物を5本の225 mLコニカル遠心チューブに移し、2,850 x g で20°Cで7分間遠心分離します。
3. 50 mLピペットで培養上清を回収し、0.22 μmのフィルターユニットでろ過滅菌します。

2. MEV の分離

1. 培養濾液を4°Cに置いた攪拌細胞限外ろ過システムに移し、濃縮液を100 kDaのカットオフメンブレンを通して<50 psiで~50 mLまでろ過します。
2. 濃縮培養濾液を15,000 x g で4°Cで15分間遠心分離し、上清を回収します。
3. ポリカーボネート超遠心分離チューブ内の培養濾液を100,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。
4. 膜状ペレットを合計1 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に穏やかなピペッティングにより再懸濁します。
5. ステップ2.4で得られたペレット懸濁液0.5 mLを1.5 mLの60%ヨウジキサノール溶液と混合し、最終的なヨウジキサノール濃度を45%wt / volにします。この混合物を13 mm x 51 mmのポリプロピレン薄肉超遠心分離管の底に分注します。
6. MEV-ヨウジキサノール45%懸濁液を、1 mLの40%、35%、30%、25%、および20%(PBSのvol/vol)ヨウジキサノール溶液と1 mLのPBSを上部に重ねます。
7. 100,000 x g で4°Cで18時間遠心分離します。
8. 1 mL ハミルトンシリンジを使用して、上から始まる 1 mL 密度勾配画分を収集します。
9. 収集した各画分をPBSで20 mLに希釈し、100,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。
10. 上清を取り除き、ペレットを0.5 mLのPBSに懸濁します。このペレットは4°Cで保存してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アミコン撹拌セル Model 108	EMDミリポア	UFSC40001	細胞限外ろ過システム
BD ポリプロピレン 225 ml コニカルチューブ	漁夫	05-538-61	円錐形遠心分離管
Biomax 100-kDaカットオフ限外ろ過膜	EMDミリポア	PBHK07610	限外濾過膜
オプティプレップ	シグマ	D1556	ヨオジキサノール
ポリカーボネート製超遠心分離チューブ 25 x 89 mm	ベックマン・コールター	355618	ポリカーボネート製超遠心分離チューブ 25 x 89 mm
ポリプロピレン薄肉遠心分離管 13x15 mm	ベックマン・コールター	344059	ポリプロピレン薄肉遠心分離管 13x15 mm
真空ろ過フラスコ	セルプロ	V50022	フィルターユニット