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1. 細菌株と培養条件
手記： この研究で使用された細菌株は、 大腸菌 MP1、 アッカーマンシアムシノフィラ、 バクテロイデス・テタイオタオミクロン、 ビフィズス菌ブレーベ、および ビフィズス菌デンティウムでした。
1. 大腸菌の場合、滅菌ループを使用して、250〜1,000 mLのルリアベルタニ(LB)ブロスに単一コロニーを接種し、培養を処理する前に、300 rpmおよび37°Cの振とうインキュベーターで48時間好気的にインキュベートします。p114-mCherryClylucを含む組換え 大腸菌 MP1株の場合、最終濃度17μg/mLでLB寒天とブロスにクロラムフェニコールを加えます。
2. A. mucinophila、 B. thetaiotaomicron、 B. breve、および B. dentium の場合、Brain Heart Infusion (BHI) 寒天プレートに縞模様を描き、ビニール嫌気性チャンバー内で嫌気的にインキュベートします。100 mLの予め還元されたBHIブロスに単一コロニーを接種し、嫌気性で48時間インキュベートします。
2. EVの絶縁
1. 遠心分離・ろ過による細菌培地の清澄化
1.ステップ1で接種した細菌細胞培養物を、250 mLまたは500 mLのポリプロピレン遠心分離機ボトルを注いで洗浄します。ボトルを大容量の固定角度ローターで4°C、5,000 × gで15分間遠心分離します。慎重に注いで上清を清潔な遠心分離機ボトルに移し、10,000 × g で 15 分間再度遠心分離します。
手記： バイオセーフティに適した洗浄と除染後にボトルを再利用してください。
1.2回目の遠心分離後に細菌細胞の大きなペレットが存在する場合は、清潔なボトルで遠心分離を繰り返して細胞をさらに除去します。
2. 上清を適切なサイズの0.22 μmポリエーテルスルホン真空駆動フィルター装置に注ぎ、移します。ろ過装置を真空壁供給に接続してろ過します。ろ過率が大幅に低下した場合は、ろ過されていない材料を新しい装置に移すだけです。ろ過した培地を4°Cで一晩保存し、必要に応じて翌日プロトコルを続行します。
手記： 上記の遠心分離では、通常、各デバイスを介して示された量の~2倍の細胞培養物を処理できます。たとえば、1つの500 mLフィルターデバイスで~1,000 mLの遠心分離培養物をろ過できます。これらのデバイスは通常、再利用されません。このステップでシリンジフィルターを使用することは、テストされたモデルで重大な損失が認められたため、最適化なしでは推奨されません。これは潜在的な停止点です。
3.ろ過された上清のアリコートを適切な寒天プレートに広げることにより、この時点で生細胞が完全に除去されていることを確認し、細菌株に最適な条件でインキュベートした後にコロニーがないことを確認します。細菌が検出された場合は、追加の遠心分離および/またはろ過を実行して、上記の手順をさらに最適化します。
2. ろ過媒体の濃度
1. 100 mL>かなりの容量で作業する場合は、手順2.2.2に進みます。~100 mLの容量で作業する場合は、血清学的ピペットを使用して、ろ過された培地90 mLをそれぞれの容量100 kDa分子量カットオフ(MWCO)遠心限外ろ過装置のリザーバーにロードします。常に対応する限外ろ過装置でバランスを取り、上部リザーバー内の培地の量が<0.5 mLに濃縮されるまで、4°Cおよび2,000 × gのスイングバケットローターで15〜30分間隔で遠心分離します。
1.残りのろ過培地をリザーバーに補充します。「補充」する場合は、デバイスの下部にあるフロースルーを取り外し、デバイスのバランスを再調整します。
手記： これらの装置を使用して濃縮できるろ過培地の最大量は、推奨量の<2倍であることが観察されました。
2.リザーバー内の濃縮培地の粘度が目に見えて増加している場合(暗い粘性のある材料)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、遠心分離によって再濃縮して、100 kDaのMWCOよりも小さい非EVタンパク質を希釈します。
手記： これは潜在的な停止点です。
3.濃縮培地を低タンパク質結合チューブに移し、4°Cで一晩保存し、必要に応じて翌日プロトコルを続行します。
2. 100 mL >かなりの容量を扱う場合は、処理する容量に対応する適切なサイズの接線方向フローろ過 (TFF) デバイス (100 kDa MWCO) を選択します。
手記： 100mLから1,000>mLまで処理するためのろ過装置が市販されています。ローカルでの入手可能性、コスト、ポンプとチューブ/接続との互換性によって、どの特定のモデルが最も有用かが決まります。フィルターを洗浄する前に、材料表に示されている装置で最大2 Lの培地を処理しました(洗浄プロトコルについては、以下のステップ2.3を参照)。
1. #16 低結合/低浸出チューブ、1/8 インチ ホースバーブ - ルアー アダプター、TFF デバイス、および蠕動ポンプを使用してろ過回路を組み立てます。
手記： バイオセーフティキャビネット内でTFFを実行して、EV製剤が環境細菌で汚染されるリスクを最小限に抑えます。
2.室温で、ろ過し、調整された培地を約200 mL / min(最小100 mL / min)で循環を開始します。200 mLのPBSを目盛り付き容器にポンプで送り込むことにより、所望の流量に対応する適切なRPMを決定します。ろ過されたコンディショニングされた培地を循環させるときは、限外ろ過膜を通過する分子<100 kDaを廃棄物として別の容器に収集します。
手記： 以下の例は、開始量を2 Lの培養物と仮定しています。
3.容量が~100〜200 mLに減少するまで、調整された培地を循環させ続けます。必要に応じて、より小さな容器に移動します。PBSで2倍に希釈し、ポンプで循環を続け、75〜100mLまで濃縮します。PBSで2倍に希釈し、最終容量25mLまで循環を続けます。PBSで2倍に希釈し、<10mLまで循環を続けます。
4.フィードチューブをサンプルリザーバーから持ち上げ、ポンプを続けてフィルターをパージし、最大量のサンプルを回収します。
手記： これは潜在的な停止点です。
5. 濃縮サンプルを円錐形のチューブに移し、必要に応じて4°Cで一晩保存します。または、プロトコルを続行します。
6. 濃縮サンプルを容量 15 mL の 100 kDa MWCO 遠心限外ろ過装置に移動します。上部リザーバー内の培地の体積が<2 mLに濃縮されるまで、4°Cおよび2,000 × gのスイングバケットローターで15〜30分間隔で遠心分離します。
手記： これは潜在的な停止点です。
7.濃縮培地を低タンパク質結合チューブに移し、4°Cで一晩保存し、必要に応じて翌日プロトコルを継続します。