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1. サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
手記： SECは、細胞外小胞(EV)の純度を高め、非小胞タンパク質を除去するために使用されます。
- <100 mLの出発物質からEVを単離するには小型のSECカラム(10 mLのベッド容量)を使用し、>100 mLの出発物質からEVを単離するには、より大きなカラム(47 mLのベッド容量)を使用します。
手記： 以下の例では、大きい方の列のボリュームをリストし、括弧で囲んだ小さい方のボリュームを示します。 - SECカラムとリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を数時間かけて室温に戻します。標準的なラボ用スタンドとホルダーを使用して、SECカラムを垂直位置に安定させます。または、市販のクロマトグラフィーカラムスタンドを使用してください。
- SECカラムに接続する前に、5 mLのPBSをフリットを通って廃棄物容器に流れ込ませて、サンプルリザーバーを水和させます。SECカラムのインレットキャップを緩め、サンプルリザーバーに2 mLのPBSを加え、PBSがフリットから滴り落ちるときにリザーバーをカラムに慎重に接続します(小型のSECカラムには適用されません)。 手記： この前のステップにより、気泡がSECカラムの上部に閉じ込められるのを防ぎます。空気が閉じ込められている場合は、リザーバーを取り外し、カラムを軽くたたいて気泡を取り出し、接続手順を繰り返します。小さい方のカラムの場合は、SECカラムの上部のキャップを外し、サンプルホッパーを取り付けるだけです。
- 47 mL(10 mL)のPBSをサンプルリザーバーに加え、SECカラムの底のキャップを外します。ロードされたすべてのサンプルバッファーをカラムを流して平衡化します。フロースルーを破棄します。
- 最大2 mL(0.5 mL)のサンプルをサンプルリザーバーにロードし、フロースルーを廃棄し、サンプルが完全にカラムに入るまで待ちます。
- PBSをサンプルリザーバーまたはホッパーに、14.25 mLからサンプル量を引いた量(スモールカラムの場合は3 mLからサンプル量を引いたもの)ですぐに追加します。溶液がカラム内を流れるようにし、カラムのボイド体積に等しい量を廃棄します。
手記： 一般的な 2 mL サンプルの場合、サンプル リザーバーまたはホッパーに添加される PBS の量は 12.25 mL になります。 - 2 mLの低結合マイクロチューブをSECカラムの真下に配置します。すぐに2 mL(0.5 mL)のPBSをサンプルリザーバーに加え、カラムに入れます。フロースルーの最初の2 mL(0.5 mL)を フラクション1としてラベル付けします。一度に2 mL(0.5 mL)をサンプルリザーバーに加え続けて、後続の各画分を収集します。
手記： ほとんどの細菌EVは、最初の5つの画分で溶出します。最適化中に、最初の12のフラクションが収集されました。 - フラクションは、短期保存(日数)の場合は4°C、長期保存の場合は-80°Cで保存します。