集束光照明を用いた糸状シアノバクテリアの走光性アッセイ

要約

出典: Weber、N. ら、 糸状シアノバクテリウム Phormidium lacunaの自然形質転換、タンパク質発現、および凍結保存。 J. Vis. 経験。 (2022年)

このビデオでは、糸状シアノバクテリアの走光性を研究するための集中的なLEDベースのアッセイを紹介します。細菌は光源に向かって移動し、照らされた中心に密な蓄積を形成し、キャプチャされた画像のピクセル強度分析によって視覚化および定量化されます。

プロトコル

1. 走光性のアッセイ
   1. 走光性実験では、選択した5mmのLEDを取り付けて、下から上に^20mm2 の領域を照射する発光ダイオード(LED)ホルダー(ここでは3Dプリンター)を用意します(図1)。必要に応じて、多数のLEDホルダーを並列に使用し、各LEDを抵抗器とポテンショメータを介して調整可能な電源に電気的に接続します。実験に応じて、LEDの強度を測定および調整します。設定全体が暗い部屋または密閉された暗い容器にあることを確認してください。
   2. Phormidium lacunaを含む培地8 mLを6 cmのペトリ皿に入れます。LEDの光の強さを調整します。ペトリ皿を蓋で閉じ、LEDがペトリ皿の中央になるようにLEDホルダーに置きます。
   3. 希望の期間(通常2日間)の後、光処理の位置に直接向けられたスマートフォンのカメラでペトリ皿の画像をキャプチャします。試料の照射には白色LEDパネルを使用します。カメラの手動設定を使用します。光の反射を避けてください。カメラレンズと標本の間の距離を同じにするように常に調整してください。露出設定で、ImageJを使用した後で分析するのに適した画像が得られることを確認してください。
   4. ImageJソフトウェアを使用して、フィラメントの中心円の直径を定量化します。
      1. ImageJを開き、[ ファイル] |開いて目的のファイルを選択し、 Enter キーをクリックします。
      2. 直線ボタン(直 線 )を選択します。マウスの左ボタンを押して、シャーレの一方の端から反対側の端まで線を引きます。線がフィラメントの円の中心を通過することを確認します。
      3. キーボードの Ctrl-K を押すか、[ 解析] | ImageJメニューのプロットプロファイル。ピクセル強度がプロットされたx-yウィンドウと距離(ペトリ皿の1Dプロファイル)を探します。最小ピクセル強度が 0 よりわずかに上回り、最大値が 255 未満であることを確認します。
      4. 円の外側のピクセル強度の平均値と、円内のピクセル強度の別の平均値を推定します。これらの値の間の y 位置で、これらの位置にマウスを向けて、円の両側の x 値を推定します。両方の値をメモし、差を計算します。
      5. 右側の y 軸にマウスを向けることで、最大の x 値を取得します。この値 e はペトリ皿の直径を表すことに注意してください。この直径が5cmの場合、 中央のフィラメント円の直径 を d / e×5cmとして計算します。

結果

図1:走光性実験。 左:調整可能な電源に接続された4つの赤色LEDを備えたLEDホルダー。各LEDの上には、8mLのフォルミジウムラクナ培養物が入った6cmのペトリ皿があります。右:赤色LED(15 μmol ^{m-2 s-1})で2日後のP.ラクナを含むペトリ皿。略語:LED=発光ダイオード。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ペトリ皿ポリスチロール、60 mm x 15 mm	メルク	P5481-500EA
光度計 ナノドロップ ND-1000	Peqlabバイオテクノロジー
光度計 Uvikon XS	ゲーベル・インストゥルメンツelle・アナリティクGmbH
ピペットマン 10-100 μL	ギルソン	商品コード: FA10004M
ソフトウェア、URL
イメージJ		イミマージュ処理用ソフトウェア(画素強度、円径)
培地
f/2 -液体媒体	人工海水、0.1%(v / v)微量元素溶液、0.05%(v / v)ビタミン溶液、0.88 mM硝酸ナトリウム、36 μMリン酸ナトリウム