方法論記事

一定の培地流量下での初代ヒト内皮細胞への肺炎球菌の付着の評価

2025年9月26日

この記事について

要約

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出典: Jagau、H. 他。定流における初代ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染 J. Vis. 経験。(2019年)

このビデオは、一定の培地流条件下で、内皮細胞上のフォン・ヴィレブランド因子(VWF)ストリングへの肺炎球菌の付着をリアルタイムで視覚化する方法を示しています。VWF 放出の刺激、文字列の標識、細菌の結合の定量化の手順の概要を説明します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. フォン・ヴィレブランド因子(VWF)放出の誘導と多量体VWFストリングの可視化

  1. VWFを最大200MDaの長いストリングに多量体化させるには、10 dyn/cm2 のせん断応力が必要なため、フロー設定を維持してください。注入ポートを使用して灌流チューブ内を循環するサプリメントミックス(ECGMS)-培地を含む100 mMヒスタミンストック溶液136 μLを内皮細胞増殖培地に注入することにより、内皮WPBからのVWFの放出を誘導します。流動媒体中のヒスタミンの最終濃度は 1 mM になります。注入ポートが利用できない場合は、ポンプリザーバーの媒体にピペッティングすることで、ヒスタミンを交互に添加できます。
  2. 多量体VWFストリングの免疫蛍光検出では、リザーバー内のバランスのとれた培地レベルに達したら流れを停止し、200 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH 7.4)のVWF特異的フルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合抗体を、注入ポートを使用して循環中の13.6 mLのECGMS培地に注入します。注入ポートが利用できない場合は、ポンプリザーバーの培地にピペッティングすることにより、抗体を交互に添加できます。これにより、最終的な抗体濃度は1.3μg/mLになります。
  3. 短時間で複数の視野を顕微鏡でスキャンするには、顕微鏡の蛍光ユニットと30%の出力のキセノン蛍光デバイスと落射蛍光カメラを使用します。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)層の形状と形態を明視野モードで監視し、VWF文字列の視覚化に適した代表的な細胞を選択します。
  4. 緑色蛍光VWFストリングを可視化するには、顕微鏡ソフトウェア(LasX)の蛍光ユニットメニューで63x/1.40オイル対物レンズと470nm検出フィルターを選択します。少なくとも50の代表的なフィールドビューのZスタックのスナップショットを作成し、それぞれに形態学的に無傷のHUVECが約10個含まれています。異なる時点での緑色蛍光VWFストリングを定量化するには、いくつかの視野をスキャンします。

2. リアルタイムでVWFストリングへの細菌の付着を顕微鏡で評価

  1. 免疫蛍光検出により、HUVEC細胞表面に生成されたVWFストリングへの肺炎球菌の付着を定量化します。
    1. フローを保持し、注入ポートを使用して、最大容量1 mLの1.35 x 108 CFU/mL赤色蛍光タンパク質(RFP)発現肺炎球菌をECGMS培地に注入します。または、バクテリアをポンプリザーバー内の培地にピペットで入れます。せん断応力を10 dyn/cm2 で再開し、バクテリアをポンプシステム内を循環させます。
    2. 顕微鏡倍率用の63倍油浸対物レンズを選択し、RFP発現肺炎球菌の検出のために顕微鏡ソフトウェアの蛍光フィルター設定をRFPチャネル(540 nm検出フィルター)に調整します。
    3. VWFストリングへの細菌の付着を定量化するには、フローを停止し、形態学的に無傷のHUVECが約10個含まれている少なくとも30の代表的なフィールドビューのZスタックのスナップショットを作成し、肺炎球菌の数をカウントします。
    4. ANOVA 1因子統計アルゴリズムを使用してデータを評価し、その後、詳細な統計比較のために事後両側対応のないサンプル検定を使用します。<0.05のP値は統計的に有意であると見なされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
灌流チューブ用クランプイビディ10821スライドをポンプシステムに接続するチューブベバーに液体を保持するため
コンピュータ谷間緯度 3440圧力ポンプソフトウェア付きコミューター
共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)ライカDMi8加熱可能なチャンバーで覆われたステージと、蛍光フィルター、キセノン光源(SP8、DMi8)、DFC 365 FX Kamera(1392×1040、1.4メガピクセル)を搭載した蛍光ユニットを備えた逆顕微鏡
リン酸水素二カリウム (KH₂PO₄)Carl Roth GmbH + Co. KG、カールスルーエ3904.1PBSバッファーに使用
乾燥材料メルク101969チューブアダプター付きのガラス瓶に使用される乾燥用オレンジシリカビーズ
ECGMサプリメントミックスプロモセルC-39215内皮細胞の前培養に必要なECGM培地用サプリメントミックス:0.02mL/mL子牛胎児血清、0.004mL/mL内皮細胞増殖サプリメント、0.1ng/mL上皮成長因子、1ng/mL塩基性線維芽細胞成長因子、90μg/mLヘパリン、1μg/mLヒドロコルチゾン
心電図プロモセルC-22010細胞接着性を高めるために5%[w/w]FCSと1 mM硫酸マグネシウムを添加したECGM
内皮細胞増殖培地(ECGM、すぐに使用可能)プロモセルC-22010HUVECの培地、サプリメントミックスのすべての成分がすでに添加されています
子牛胎児血清(FCS)バイオクロームはメルクにエス 0415感染分析に使用される細胞培養用サプリメント
FITC結合ヤギ抗ヒトVWF抗体アブカムAB8822ストック濃度:10 mg/mL、フロー中の球状および多量体VWFの免疫検出用
流体ユニットイビディ10903フロー栽培用流体ユニット
ゼラチン(ブタ)シグマ・アルドリッチG-1890-100gマイクロスライドチャネル表面のプレコーティング用
ヒスタミン二塩酸塩シグマ・アルドリッチH-7250-10MG型内皮Weibel Palade体からのVWF分泌の誘導に
ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)プロモセルC-12203 ロット番号396Z042プールドナーからの初代内皮細胞、液体窒素中で保存されたcrypcoserved
マウス由来のヒトVWF特異的抗体(モノクローナル)サンタクルスSC73268ストック濃度:PFA固定後のマイクロ流体スライド中のVWFの免疫染色用200μg/mL
インジェクションポートイビディ10820フロー循環中にリザーバーチューブにヒスタミンまたは細菌を注入するため
ルアースライド I0.4 (ibiTreat472マイクロスライド)イビディ80176あらゆる種類のフローアッセイに適したフルディック培養用の物理的に改質されたスライド(チャネル高さ0.4mm、チャネル容量100μl、成長面積2.5cm、コーティング面積25.4cm²のスライドI0.4ルアー μ)は、物理的処理により親水性と粘着性のある表面を生成します。
硫酸マグネシウム(MgSO₄、無水和)シグマ・アルドリッチM7506-500GECGMS培地の調製用
マイクロ流体ポンプイビディ10905空気圧ポンプ
灌流セットイビディ10964灌流セットイエロー/グリーンは、チューブ径1.6mm、チューブ長50cm、総作業量13.6mL、デッドチューブ容量2.8mL、リザーバーサイズ10mLです。μスライドL0.4Luerと組み合わせると、37°C、粘度0.0072 dyn x s/cm2 で、3.8mL/minから33.9 mL/minまでの流量範囲と3.5 dyn/cm²から31.2 dyn/cm²のせん断応力に達することができます。マイクロ流体用長さ50cm
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)  溶液は、0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na₂HPO₄、0.24 g/L KH₂PO₄、pH 7.4 の化学物質を使用して調製しました。
塩化カリウム(KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG、カールスルーエ6781.1PBSバッファーに使用
ポンプ制御ソフトウェア(PumpControl v1.5.4)イビディバージョン1.5.4圧力ポンプの制御、流量条件の設定、流量の開始/終了のためのコンピュータソフトウェア
RFP発現性肺炎球菌National Collection of Type Cultures、イングランド公衆衛生局10,319Streptococcus pneumoniae 血清型47を発現するRFPは、ゲノムに組み込まれたヒストン様タンパク質に融合しました

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