ゼブラフィッシュ胚における生体材料関連細菌感染の蛍光イメージング

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ゼブラフィッシュ胚における感染の進行と誘発された細胞浸潤の蛍光顕微鏡検査

1. 胚を0.02%(w / v)3-アミノ安息香酸(トリカイン)を含む100 mmのペトリ皿に入れて麻酔し、胚を麻酔します。5分後、胚を0.02%(w / v)トリカインを含むE3培地で重ねたアガロースプレートに移し、注射用に1つの方向に整列させます。500 μL の PBS(リン酸緩衝生理食塩水)-2% (wt) メチルセルロース溶液を、0.02% (w/v) トリカインを含む E3 培地を含むペトリ皿にピペットで入れます。胚をメチルセルロース溶液に入れ、まっすぐかつ水平に保ちます。
   手記： メチルセルロース溶液は「接着剤」として使用され、その粘度により、胚をイメージングに最適な方向に一時的に固定することができます。
2. 明視野、mCherry、緑色蛍光タンパク質(GFP)、およびUV(紫外線)フィルターを備えた実体蛍光顕微鏡を使用して、160倍の倍率で、同一の最適化された設定(強度、 ゲイン、露光時間など)で個々の胚を画像化します。明視野フィルターを使用して、注射によって引き起こされる組織の損傷に焦点が合うように焦点面を設定します。Zスタックの深さを10μm、ステップサイズを5μmに設定すると、3枚連続した画像を記録できます。
3. 注射後5時間から注射後2日まで、個々の胚を1日1回画像化します。さらなるイメージングと分析のために、死んだ胚(心拍がない、または胚が部分的に分解されている)を除外します。胚を48ウェルプレートのE3培地で個別に維持します。毎日培地をリフレッシュしてください。