ゼブラフィッシュ胚を用いたインプラント関連細菌感染症のin vivo解析

要約

出典: Zhang、X. ら、 生体材料関連 黄色ブドウ球菌 感染の生体内視覚化および生体内分析のためのゼブラフィッシュ胚モデル。 J. Vis. 経験。 (2019年)

このビデオは、移植された生体材料に関連する感染症を研究するためのゼブラフィッシュ胚モデルを示しています。 黄色ブドウ球菌に ポリスチレンマイクロスフェアを注射すると、細菌の生存率が向上し、移植された材料の感染促進の役割が確認されます。

プロトコル

1. 細菌のみおよび細菌-マイクロスフェア懸濁液の調製

手記： mCherry蛍光タンパク質を発現する 黄色ブドウ球 菌RN4220株(黄色ブドウ球菌-mCherry)を使用しています。 黄色ブドウ球菌 RN4220株は、病原性調節遺伝子 agrA (補助遺伝子調節因子A)で変異しているため、ゼブラフィッシュ胚モデルでは病原性が比較的低い可能性があります。他の 黄色 ブドウ球菌株または生体材料関連感染症 (BAI) 用の他の細菌種を使用できます。

1. 10 μg/mLクロラムフェニコールを添加したトリプシン大豆寒天培地プレートから黄色ブドウ球菌RN4220細菌の4〜5コロニーを取り、10 μg/mLクロラムフェニコールを添加した10 mLのトリプシン大豆ブロスで中対数成長期まで培養し、振とうしながら37°Cで培養します。
   1. 培養中、キュベット(幅1 cm)で100 μLの細菌懸濁液を900 μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、620 nm(OD₆₂₀)で光学密度(OD)を測定します。OD₆₂₀ が0.4〜0.8に達するまで細菌を培養します。
      手記： 0.1のOD₆₂₀ は、一般に3.0 x 10⁷ コロニー形成単位(CFU)/ mLに相当 します。対数成長期中期の細菌の接種物のOD₆₂₀ は、0.4〜0.8の間です。他の種や細菌株では、培養に異なる期間が必要になる場合があります。
2. 細菌を3,500 x g で10分間遠心分離し、ペレット化された細菌を1 mLの滅菌PBSに再懸濁します。続いて、細菌を滅菌PBSで2回洗浄し、最後にPBS中の1.1 mLの4%(w / v)ポリビニルピロリドン40(PVP40)溶液に細菌を再懸濁します。
3. この細菌懸濁液をボルテックスし、OD₆₂₀ 測定用のキュベット内の900 μLの滅菌PBSで100 μLの懸濁液を希釈します。PVP40溶液で細菌懸濁液の濃度を調整します。これが「バクテリアのみ」の懸濁液です。
4. 生体材料は、細菌懸濁液と混合するために自由に選択できます。本研究では、市販のポリスチレン(PS)マイクロスフェア(青色蛍光、10μm)を使用しています。バクテリア-マイクロスフェア懸濁液を生成するには、ミクロスフェアを室温で1,000 x gで1分間遠心分離し、上清を廃棄し、マイクロスフェアを「バクテリアのみ」懸濁液(PVP40溶液中)に再懸濁します。
5. マイクロスフェアの存在下と非存在下でほぼ等量の細菌を注入するには、バクテリア-マイクロスフェア懸濁液の濃度は、「バクテリアのみ」懸濁液(マイクロスフェアなし)の濃度の3分の2である必要があります。これは、バクテリア-マイクロスフェア懸濁液を0.5容量のPVP40溶液で希釈することによって達成されます。懸濁液をボルテックスして混合します。注目すべきは、この比率(3分の2)が黄色 ブドウ球菌について評価されていることです。表 皮球菌にも適していますが、この比率が他の細菌種や他のサイズ(10μm以上)や注入する生体材料の形状(マイクロスフェア以上)にも当てはまるかどうかを確認することをお勧めします。
6. 「バクテリアのみ」およびバクテリア-マイクロスフェア懸濁液の濃度を、以下のように10倍の連続希釈液の定量培養により確認します:100 μLの懸濁液を96ウェルプレートに移し、懸濁液の10 μLアリコートを90 μLの滅菌PBSに移すことによって連続希釈します。アガロースプレート上に原液および希釈懸濁液の10 μLアリコートを複製し、プレートを37°Cで一晩インキュベートし、コロニーをカウントし、細菌の数(コロニー形成単位、CFU)を計算します。

2. ゼブラフィッシュ胚の繁殖、収穫、維持

1. ゼブラフィッシュ胚の繁殖、収穫、および維持に関する一般的な手順に従い、以下に説明する変更を加えます。野生型トゥッフェル長鰭(TL)ゼブラフィッシュまたは選択されたトランスジェニック系統のゼブラフィッシュ(ここでは、Mpeg1:Kaede)の家族を、光が点灯した後に成体メスに卵を産むように誘導するために網を追加した水槽で交配し、生成された卵から成虫を分離します。
2. 翌日、胚を集め、生存できない不透明な胚を捨てます。ペトリ皿(直径100 mm)あたり約60個の胚をE3培地に保持し、28°Cでインキュベートします。死んだ胚や異常な胚を取り除き、E3培地を毎日リフレッシュします。

3. 注射針の準備

1. マイクロピペットプーラー器具を使用して、注射用のガラスマイクロキャピラリーニードルを準備します。次の設定を使用します: 熱: 772、引っ張り: 100、ベル: 200、時間: 40、ガス: 75。
2. 針の外径が約20μm(10μmの微小球の場合)の位置で鉗子で針先を折り、眼にスケールバーを備えた光学顕微鏡を使用します。胚の生存を損なうため、開口部サイズが非常に大きい針は避けてください。
   手記： 開口部は、注入する生体材料のサイズと形状に応じて、より小さくまたは大きく選択できます。文献では、開口部が約 50 μm の針を使用した注射は、胚の生存率を大幅に低下させることが報告されています。

4.ゼブラフィッシュ胚への細菌のみまたは細菌-微小球懸濁液の注入

1. 電子レンジを使用してアガロース溶液(半水中で1〜1.5%(wt))を加熱し、100 mmのペトリ皿に注ぎます。ペトリ皿内のアガロース溶液の上にプラスチック製の型テンプレートを置き、アガロースにくぼみを作り、胚を適切な位置に配置し、注射を容易にします。室温でインキュベートし、アガロース溶液が固まったらカビを取り除きます。
2. 受精後3日で、胚を0.02%(w / v)3-アミノ安息香酸(トリカイン)を含む100 mmのペトリ皿に入れて麻酔します。5分後、胚を0.02%(w / v)トリカインを含むE3培地で重ねたアガロースプレートに移し、注射用に1つの方向に整列させます。Mpeg1の場合:Kaedeトランスジェニックラインは、最初に0.02%(w / v)トリカインを含むE3培地で胚を麻酔します。次に、実体蛍光顕微鏡を使用して緑色の蛍光タンパク質を発現する胚を選択します。
3. マイクロローダーピペットチップを使用して、約10 μLの「バクテリアのみ」またはバクテリア-マイクロスフェア懸濁液を針にロードします。マイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに針を取り付けます。ここで使用するインジェクター( 材料表を参照)については、2〜3 nLの注入には次の設定を使用します:圧力:300〜350、背圧:0、時間:2 ms。注意: マイクロインジェクターの設定は、使用するインジェクターによって異なります。他の形状やサイズの生体材料と混合された細菌を注射する場合は、インジェクターの設定を調整する必要がある場合があります。
   1. 「バクテリアのみ」懸濁液とバクテリアマイクロスフェア懸濁液の注入には、同じ開口部の針を使用してください。針が折れたり詰まったりした場合は、さらに注射するために必ず新しい針と交換してください。
4. 針と胚の体の間の45〜60°の角度で、光学顕微鏡下で胚の筋肉組織に針を挿入します(図1)。針をゆっくりと前後に動かして、組織内の針の位置を調整します。マイクロインジェクターに接続されたフットペダルを使用して胚を注入します。
5. 蛍光菌を注射した後、実体蛍光顕微鏡で感染が成功するように胚を採点します。スコアが陰性の胚を破棄します(目に見える蛍光細菌がない、または目に見える蛍光微小球がない)。胚を48ウェルプレートのE3培地で個別に維持します。毎日培地をリフレッシュしてください。

5. 胚の粉砕、顕微鏡スコアリング、細菌の定量培養

1. 実体蛍光顕微鏡を使用して、注射直後から開始し、胚が定量培養のためにランダムに選択されるまで、その後の各日に、蛍光菌の存在についてすべての胚を顕微鏡でスコアリングします。
2. 注射直後にいくつかの生きた感染胚(本研究では5〜6個)をランダムに選択し、滅菌チップを使用して個別に2mLマイクロチューブに移します。培地を取り出し、胚を滅菌PBSで1回穏やかに洗浄し、100 μLの滅菌PBSを加えます。
3. 各バイアルに2〜3個の滅菌ジルコニアビーズ(直径2 mm)を加え、ホモジナイザー( 材料表を参照)を使用して胚を3,500 rpmで30秒間粉砕します。ステップ1.3で説明するように、ホモジネートを定量的に培養します。
   手記： 他のホモジナイザーでは、異なる設定が必要な場合があります。
4. ステップ5.3に従って定量培養のために、注射後数日に複数の胚をランダムに選択します。

結果

図1:ゼブラフィッシュ胚の尾筋へのバクテリア-マイクロスフェア懸濁液の同時注入の概略図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリプシン大豆寒天	BDディフコ	236950	AMCのメディア準備ユニット
トリプシン大豆ブロス	BDディフコ	211825
ポリビニルピロリドン40	応用	A2259.0250
直径10μmのポリスチレンマイクロスフェア(青色蛍光灯)	ライフテクノロジー/ThemoFisher	F8829
ガラスマイクロキャピラリー(外径1mm×内径0.78mm)	ハーバード大学装置	30-0038
マイクロピペットプーラー器具	サッター・インストゥルメント株式会社	炎のp-97
光学顕微鏡 LM 20	ライカ	MDG33 10450123
3-アミノ安息香酸(トリカイン)	シグマ・アルドリッチ	E10521-50G
アガロースMP	ロシュ	11388991001
実体蛍光顕微鏡 LM80	ライカ	MDG3610450126
マイクロローダーピペットチップ	エッペンドルフ	5242956.003
マイクロマニピュレーター M3301 M10スタンド付き	世界の精密機器	00-42-101-0000
FemtoJet expressマイクロインジェクター	エッペンドルフ	5248ZO100329
マイクロトゥルーブ 2ml pp	ザルシュテット	72.693.005
ジルコニアビーズ	バイオコネクト	11079124ZX
MagNAライザー	ロシュ	41416401
クロラムフェニコール	シグマ・アルドリッチ	C0378
ジャイロトリーシェーカー(細菌増殖用)	ニューブランズウィックサイエンティフィック	G10
ゼブラフィッシュインキュベーター	VWRの	インクライン
キュヴェット	ブランド	759015
遠心機	ヘティッヒ・ゼントリフューゲン	ロタンタ 460R
分光 器	ファーマシアバイオテクノロジー	ウルトロスペック®2000
鉗子	シグマ・アルドリッチ	F6521-1EA
48ウェルプレート	グライナーバイオワン	677180
96ウェルプレート	グライナーバイオワン	655161
ペトリ皿	隼	353003
ペトリ皿	Biomerieux (バイオメリュー)	NL-132