単一細胞細菌接種物の調製

要約

出典: Niu、L.、 et al.、 生体内顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染中のマクロファージ溶解細胞死の視覚化。 J. Vis. 経験。 (2019年)

このビデオでは、感染アッセイや下流アプリケーションで一貫して使用するために、後期対数期培養物から Mycobacterium marinum 単一細胞懸濁液を調製する方法を示します。

プロトコル

1. Mycobacterium marinum 単一細胞接種物の調製(図1)

1. セルリアン蛍光 マイコバクテリウムマリナム グリセロールストックを-80°Cから解凍し、7H10寒天プレートに10%(v / v)OADC(オレイン酸、アルブミン、デキストロース、カタラーゼ)、0.25%グリセロール、および50μg/mLのハイグロマイシンを接種します。プレートを32°Cで約10日間インキュベートします。
2. 陽性蛍光を発現するコロニーを選択し、3 mLの7H9培地に10%OADC、0.5%グリセロール、および50μg/mLのハイグロマイシンを接種します。
   1. 培養物が対数期(OD₆₀₀ = 0.6-1.0)に達するまで、接種を32°Cおよび毎分100回転(rpm)で4〜6日間インキュベートします。
   2. OD₆₀₀ が~1.0に達するまで、10%OADC、0.5%グリセロール、0.05%Tween-80、および50 μg/mLを含む30 mLの新鮮な7H9培地で継代培養(1:100)。
      手記： この時点で、最高の培養品質を得るには、サブカルチャーステップが推奨されます。私たちの経験では、クローンを大量の培地に直接添加すると、細菌の塊が形成されます。
3. 以下に説明するように M.marinum 細胞を収集します。
   1. 3,000 x g で 10 分間遠心分離して、 M. marinum をペレットとして収集します。300 μLの上清を除くすべてを廃棄し、ペレットの再懸濁に使用します。
   2. 10%グリセロールを含む3 mLの7H9培地を加えてペレットをさらに再懸濁させ、次に懸濁液を100 Wのウォーターバスで15秒オン、15秒オフで合計2分間超音波処理します。
      手記： 超音波処理は、接種物の単一細胞ホモジネートを達成するために使用され、マイクロインジェクション針が詰まるのを防ぎます。
4. 細菌懸濁液を10mLシリンジに移し、5μmフィルターに通して塊を取り除きます。
5. 分光光度計を使用して懸濁液の光学密度(OD)を測定し、10%グリセロールを含む7H9培地でOD₆₀₀ = 1.0に希釈します。懸濁液を10 μLのアリコートに分け、将来の使用のために-80°Cの冷凍庫に保管します。
6. 10%(v/v)、0.5%グリセロール、50μg/mLのハイグロマイシンを含む7H10寒天プレートに細菌ストックを連続希釈してプレーティングすることにより、接種物の細菌濃度(cfu/mL)を確認します。

結果

図1:単一細胞細菌調製の概略図。 単一細胞セルリアン蛍光 マイコバクテリウムマリウム ストックは、記載されたプロセスに従って生成されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05% トゥイーン-80	シグマ	P1379
10 mLシリンジ	ソーラービオ	YA0552
10% OADC	BDの	211886
5μmフィルター	ミッレX	SLSV025LS
50 μl/ml ハイグロマイシン	サンゴンバイオテック	A600230
7時間10分	BDの	262710
7H9	BDの	262310
環境室	ペコン	温度制御 37-2デジタル
エッペンドルフマイクロローダー	エッペンドルフ	第5242956003号
グリセロール	サンゴンバイオテック	A100854
孵卵器	キールライン	PH-140(A)
マイコバクテリウム・マリナム			ATCC BAA-535
ソニケーター	サイクンツ	JY92-IIDN
分光光度計(OD600)	エッペンドルフAG	22331 ハンブルク