ラット肺内皮細胞の細菌感染後の細胞傷害性アミロイドの取得

要約

出典:Balczon、R.、et al。緑膿菌による肺内皮細胞感染後の細胞傷害性アミロイドの検出法J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオは、 緑膿菌に感染した後、肺内皮細胞から細胞傷害性上清を生成する手順を示しています。細菌のエフェクタータンパク質がどのように宿主細胞構造を破壊し、細胞傷害性アミロイドオリゴマーの上清への放出を誘導するかを概説します。

プロトコル

1. 細胞毒性上清の生成:

ラット肺微小血管内皮細胞(PMVEC)の初代培養物は、南アラバマ大学肺生物学センターの細胞培養コア施設から採取されました。

1. 細胞傷害性上清を生成するには、2 x 10⁶ 細胞を個々の150 cm皿にプレートし、コンフルエンスが達成されるまで3〜4日間増殖させます。実験ごとに2枚のプレートを使用します。
2. 上清を生成するには、PMVECの2つの150 cm皿のうちの1つをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、トリプシン処理してから細胞をカウントします。PMVECのもう一方の皿をハンクの平衡塩溶液(HBSS)で洗浄し、20:1の感染多重度(MOI)で緑 膿 菌のいずれかの株に感染させます。これは次のように実現されます。
   1. 緑 膿菌の場合、OD₅₄₀ 0.25 = 2 x 10⁸ CFUs/mL。この希釈液を調製するには、1 mLの使い捨てキュベットに1 mLのHBSSを加えます。分光光度計を使用して測定したときにOD₅₄₀ が0.25に達するまで、プレートから十分なバクテリアをこすり落とします。次のステップでは、必要なバクテリアの量を計算します。
   2. 培養皿内のPMVECの数が決定されたら、PMVECを含む2番目のトリプシン化されていない培養皿に添加する細菌の適切な数を決定します。例えば、PMVECの培養皿に1.3×10⁷ 細胞が含まれていると判断された場合、1.3×10⁷ 細胞×20菌/細胞×1mL/2×10^8CFU =1.3mL菌を調製する。
   3. 1.3 mLの細菌をHBSSに希釈して最終容量20 mLにし、150 cmの皿の表面全体を液体で覆うようにし、希釈した細菌をPMVECのプレートに加えます。
   4. 細菌を接種したPMVECを5%CO₂ インキュベーターで37°Cで4〜5時間インキュベートし、プレートを顕微鏡で観察すると細胞単層にギャップが形成されているのが見られるまでインキュベートします(ギャップ形成の適切なレベルについては 、図1 を参照)。
   5. 上清を回収し、卓上遠心分離機で2,000 x g で10分間遠心分離し、細胞破片を除去します。
      手記： このステップには、未溶解細胞と大きな細胞断片をペレット化するのに十分なg力を生成できる卓上遠心分離機を使用できます。
   6. 上清を先端に0.2μmのフィルターが取り付けられたシリンジに注ぎ、上清をフィルターに通して細菌を除去します。
   7. 滅菌上清のアリコートを使用して細胞毒性をテストし、将来の使用のために残りの上清を-80°Cで凍結します。

結果

図 1. PMVEC形態に及ぼす緑 膿菌 接種の影響緑 膿菌のPA103株の添加前(A)および添加後(B)4時間後のPMVECのコンフルエント単分子層感染した細胞の細胞単層にはっきりとギャップが見られます。スケールバー = 100 μm

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HBSSの	ギブコ	14025-092
PBSの	ギブコ	10010-023
0.22ミクロンのシリンジフィルター	ミリポール	SLGP033RS
DMEMの	ギブコ	11965-092
Countess 自動セルカウンター	インビトロゲン	C10277
マイクロセトリフュージョン濃縮器 - 10,000 MWカットオフ	ミリポール	UFC801008
株PA103およびΔPcrV			緑膿菌のこれらの株は、ウィスコンシン大学医科大学(ウィスコンシン州ミルウォーキー)のダラ・フランク博士から入手されました
寒天	漁夫	BP1423-500
ウシ胎児血清	ハイクローン	SH30898.03IH
ペンストレップ	ギブコ	15070063