細胞内に目的の遺伝子を導入することは生体内でその機能を解明するための強力な方法です。このプロトコルは、AmaxaによるNucleofectorエレクトロポレーション装置を用いてヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）の文化をトランスフェクションの効率的な方法を説明します。
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この記事について
サマリー
要約
このような一般的に使用されるカチオン性脂質トランスフェクション試薬によるヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）、などの主要な哺乳類の神経細胞のトランスフェクションは、しばしば貧しい細胞の生存率と低いトランスフェクション効率をもたらした。このような遺伝子銃やマイクロインジェクションのような目的の遺伝子を導入する他の機械的な方法は、、悪い細胞の生存およびトランスフェクトした細胞の数が少ないことも限られている。初代細胞への外来遺伝子を導入するウイルスコンストラクトを使用しての戦略は、ウイルスベクターおよび潜在的な安全上の懸念を作成するために必要な時間と労力の両方によって制限されてきました。ここでは特に神経幹細胞のトランスフェクションに最適化された電流パラメータとバッファのソリューションでAmaxaのNucleofector装置と技術を使用してhNSPCsをトランスフェクトするためのステップバイステップのプロトコルを説明します。このプロトコルを使用して、我々は、〜35％の初期のトランスフェクション効率を達成し、安定したトランスフェクション後70％〜を有している。プロトコルは、Nucleofectorデバイスとエレクトロポレーションに続いて適切なバッファにトランスフェクトされるDNAとhNSPCsの高い数を組み合わせることが伴います。
プロトコル
注：継代ヒト神経幹細胞の記事（への参照https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ）とカウントヒト神経幹細胞の記事（ https://www.jove.com /インデックス/ Details.stp？ID = 262 hNSPCsを再懸濁し、カウントする方法を学ぶ）。
準備
- トランスフェクションのための使用可能なセル（各DNAは数百万の細胞がトランスフェクトされる）の多くがあることを確認してください。
- コートトランスフェクトした細胞をトランスフェクションの前に夜10μg/ mlのヒトフィブロネクチンと、シードされるに組織培養皿を、。右のトランスフェクションプロトコールを開始する前に、、フィブロネクチンを除去PBSで皿を洗い、そして皿の場所の培養培地。メディアを温めるために37℃の組織培養インキュベーターで皿を残す。また、37〜プレ暖かい℃にインキュベーターで培養培地1 mlを置く
- 氷の上に、トランスフェクトされるDNA（S）、およびトランスフェクション溶液を（Amaxaから）に置きます。
トランスフェクション
- PBSで細胞（我々は通常、トランスフェクションあたり〜5 × 106細胞を使用する）の定義の数を洗ってください。ペレットを遠心分離（1000 rpm 5分間（〜200xg））によって細胞、できるだけ多くのPBSと削除、およびトランスフェクションキットに付属のトランスフェクション溶液100μlに細胞ペレットを再懸濁します。 1.7ミリリットルエッペンドルフチューブに細胞懸濁液を移す。
- 細胞懸濁液にDNAを5μl（トランスフェクションあたりのDNAの5〜10μg）を加え、穏やかに混ぜる。
- Amaxaミニピペットを使用して、Amaxaのトランスフェクションのキュベットに細胞- DNA混合物を転送する。あなたが次のステップのための予め温めておいた培地1 mlを持っていることを確認してください。また、インキュベーターから培養培地で細胞の皿を削除し、組織培養フードに入れてください。
- Nucleofectorにキュベットを置き、ホイールを時計回りに回転させ、プログラム"A - 033"を選択します。 Enterキーを押します。
- 成功したトランスフェクションは、キュベット内の溶液の上に泡の非常に緻密層の存在によって示されます。キュベットに500μlの暖かいメディアを追加する、とAmaxaミニピペットを用いて、予め温めておいた培地とシャーレにトランスフェクションされた細胞を移す。より暖かいメディアとキュベットをすすぎ、同じ皿にリンスを追加。 37℃の組織培養インキュベーターで細胞と皿を置きます。
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ディスカッション
このプロトコルは、hNSPCsため、比較的迅速かつ効率的なトランスフェクションの手順を説明します。この手順を使用して、我々は、〜35％の初期のトランスフェクション効率を得ている。選択剤が安定にトランスフェクトされた人口を生成するために使用されている場合は、この手順でトランスフェクトした細胞は、短期試験（過渡的にトランスフェクションした細胞）のためにまたは長期的な研究に使用することができます。我々は、外来タンパク質を発現する細胞の70％を〜する安定にトランスフェクト細胞を生成している。一過性にトランスフェクトhNSPCsでは、我々は〜7日間のための外因性蛋白質の継続的な発現を観察した。
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謝辞
著者らは、子供の病院、hNSPC文化を提供するためのオレンジカウンティ研究所で国立ヒト神経幹細胞資源の博士フィリップH.シュワルツ氏に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| Nucleofectorデバイス | ツール | Amaxa | AAD-1001 | |
| マウス神経幹細胞用ヌクレオフェクターキット | 試薬 | Amaxa | VPG-1004 |
参考文献
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
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