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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
- 注射による細菌株の動物への接種
- 注射の朝に、試験中の細菌株のクライオバイアルを取り出し、4°Cで3〜4時間解凍します。注射するマウスごとに0.5mLを解凍します。解凍後、バイアルを氷の上に置き、2時間以内にマウスを注射します。
- 解凍後、各クライオバイアルを新しい2 mLチューブに移し、4,500 x g で10分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを1 mLの1 mL PBS(リン酸緩衝生理食塩水)に再懸濁します。
- 再び4,500 x g で10分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを1x PBSに再懸濁し、最終濃度2.5 x 109 CFU/mL(CFU:コロニー形成単位)にします。使用する 1x PBS の正確な量は、株によって若干異なります。
- 各株の最終懸濁液から3つのサンプルを採取して、上記のようにCFU/mL、遺伝子型、および表現型を検証します。
- 株ごとに、5 匹のマウスごとに 1.5 mL の PBS/細胞懸濁液を 1 本の 2 mL チューブに分注して、チューブの挿入回数を制限します。また、対照注射用の1x PBSのチューブを準備します。
- マウス(この実験ではグループあたりオス10匹、メス10匹のC57BL/6)と注射に必要な材料(注射器、針、鋭利物容器、マーカー、ペンと紙など)を集めます。無菌動物手術室に移動します。すべての表面を消毒用ワイプで拭きます。
- 実験者の苦痛と怪我のリスクを排除するために、一度に1つの性別と実験グループのマウスを手術室に連れて行きます(たとえば、特定の系統に感染する10匹の雄マウスのグループ)。噛まれた場合の手袋の穴を防ぐために、ラテックス手袋を2組着用してください。汚染を避けるために、白衣、安全メガネ、フェイスマスクを着用してください。
- 対照群に1x PBSの注射を開始します。これにより、注射のみで副作用が生じるかどうかが確認されます。
- ケージからマウスを取り出します。マウスは一度に 1 つだけ削除してください。
- マウスの体重を量り、尾に油性マーカーで印を付けて、注射後の体重減少を追跡します。
- 新しい1 mLシリンジと27 G針を開き(汚染を除去するために各マウスに新しいシリンジと針を使用します)、200 μLの滅菌1x PBSを注入します。
- 親指と人差し指を使ってマウスの耳の後ろをつかみます。つまんで首筋に皮膚のひだを作り、つかみます - ひだがきつくなると、首の動きが減り、注射中に噛まれるリスクが軽減されます。小指を使用して尾を手のひらに固定し、マウスをほとんど動かさずに平らに保持します。
- マウスを裏返し、正中線の左側または右側の腹腔に30°の角度で針を挿入します。挿入したら針を少し持ち上げて、臓器ではなく腹腔内領域に挿入されていることを確認します。PBSをゆっくりと注入してから、針を引き抜きます。
- 使用済みの針を指定されたバイオハザード鋭利物容器に入れます。注射器や針を再利用しないでください。注射部位でのボーラスが典型的です。
- 注射後、マウスを別のケージに移動します。
- 次のマウスで手順を繰り返します。1つのケージのマウスをすべて注射した後、すぐに元のケージに戻します。
- 対照群を注入した後、同じ手順に従って試験する菌株の懸濁液の注入を開始します。
- 200 μLの細胞懸濁液を注入します。2.5 x 109 CFU/mLの細胞懸濁液から開始する場合、各マウスは5 x 108 CFUを受け取ります。
手記： これらの濃度は、各株の致死量を決定するための予備的な動物研究によって最適化されました。投与量は、他の株/種に合わせて調整する必要がある場合があります。
- すべての注射が完了したら、マウスをハウジングルームに戻して苦痛を軽減します。消毒用ワイプで作業エリアを掃除します。
- 3時間ごと72時間、12時間ごとに10日間死んだマウスがないかケージをチェックして、注射後の動物の死亡率を監視します。マウスの体重を12時間ごとに記録して、病気による体重減少を判断します。