標的遺伝子欠失のための緑 膿菌 の二重クロスオーバー組換え体の生成

要約

出典:バレンタイン、ME、他。Pseudomonas aeruginosaにおけるインフレーム遺伝子欠失変異株の作製と感染の単純なマウスモデルにおける病原性減衰の試験J. Vis. 経験。 (2020)。

このビデオでは、プラスミドベースの遺伝子欠失戦略を使用した緑 膿 菌におけるダブルクロスオーバー組換え体の生成を示します。このプロセスでは、単一のクロスオーバーを介してゲノムに組み込まれた非複製プラスミドを保有する細菌を選択し、スクロース選択下で2回目の組換えイベントを誘導してプラスミドを切除します。ダブルクロスオーバー組換えの成功は、抗生物質耐性の喪失とスクロース含有培地での増殖能力によって確認されます。

プロトコル

1. 緑膿菌の二重クロスオーバー組換え体の検出

1. ブロス培養ごとに、10%スクロース(グリセロールなし)を添加したPIA(シュードモナス 分離寒天培地)の予熱プレートに10 μLの培養物を接種し、単離されたコロニーの縞模様を添加します。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
2. 翌日、インキュベーターからプレートを取り出し、成長を検査します。スクロース耐性コロニーは、二重クロスオーバー組換え体である必要があります(すなわち、プラスミドインサートの他の相同領域と緑 膿菌 染色体の間の組換えイベントを介して染色体からプラスミドを除去しました)。
   1. 1)PIA、2)10%スクロース(グリセロールなし)を添加したPIA、および3)300 μg/mLのカルベニシリンを添加したPIAの予熱したプレートに滅菌つまようじで少なくとも20コロニーをパッチします。
3. プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
4. インキュベーターからプレートを取り出し、成長を調べます。真のダブルクロスオーバー組換え体は、カルベニシリン感受性およびスクロース耐性です(つまり、スクロースを添加したPIAおよびPIAでは増殖したが、カルベニシリンを添加したPIAでは増殖しなかったコロニー)。

材料