出典: Schlimpert、S.、 et al。 マイクロ流体装置を用いたS .ベネズエラ の全ライフサイクルの蛍光タイムラプスイメージング J. Vis. 経験。 (2016年)
このビデオは、 Streptomyces venezuelaeからの胞子の培養と単離を示しています。細菌がストレスから生き残るのを助ける休眠細胞である胞子は、栄養制限中に生成され、遠心分離によって収集されます。この方法により、下流用途向けの純粋な低温保存胞子懸濁液が保証されます。
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方法論記事
液体培養物からのStreptomyces venezuelae胞子の調製と単離
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2025年9月26日
この記事について
要約
プロトコル
1. 新鮮な Streptomyces venezuelae 胞子の単離と使用済み培地の調製
- 60 μl の R2 微量元素溶液 (TE) を添加した 30 ml のマルトース酵母エキス - 麦芽エキス (MYM) 培地に、SV60 株の胞子 10 μl [attBφBT1::p SS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)] を接種します。細胞の一貫した増殖と胞子形成のために、十分な通気を可能にするためにバッフルフラスコまたはスプリングを含むフラスコを使用してください。
- 細胞を30°C、250rpmで35〜40時間培養します。
- 液体に取り付けられた位相差顕微鏡で細胞を調べます。この時点で、菌糸体の断片と胞子が見えます。
- 卓上遠心分離機で1mlの細胞を400 x g で1分間遠心分離し、菌糸体とより大きな細胞断片をペレット化します。
- 胞子の懸濁液を含む約300μlの上清を新しい1.5mlチューブに移し、氷上に置いておく。残りの培地を保管してください
- 胞子をMYM-TEで1:20に希釈し(最終濃度:0.5-5 x 107 胞子/ ml)、必要になるまで氷の上に置きます。
注: ストレプトミセス で胞子形成を引き起こす正確な条件は理解されていませんが、胞子形成培養からの未知の細胞外シグナルを含む、使用済みのMYM-TE培地を使用すると、胞子形成が刺激されます。 - 残りの培地10mlをろ過滅菌して、胞子や菌糸体断片のない使用済みMYM-TEを得る。滅菌0.22 μmシリンジフィルターを使用し、使用済みのMYM-TEを滅菌15 mlチューブに移します。
- 同様の増殖条件を使用して追加の実験を行う場合は、調製した使用済みMYM-TEを4°Cで数日間保管します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| マルトース酵母エクストラクト麦芽エキス(MYM)4 gマルトース4 g酵母エキス10 g麦芽エキス50%水道水と50%逆浸透水を使用して1 L H2Oを加え、オートクレーブ滅菌後100 mlあたり200 mlのR2微量元素溶液を補充します | Streptomyces venezuelae SV60の培養に使用される胞子形成培地 | ||
| R2 微量元素溶液 (TE)8 mg ZnCl240 mg FeCl 3-6H2O2 mg CuCl 2-2H 2O2 mg MnCl2-4H 2O2 mg Na2B4O7-10H 2O2 mg (NH4)6Mo7O24-4H 2O添加物 200 ml H2OAutoclave および 4 °C で保存 | 0.002 ボリュームを MYM に追加する | ||
| PBS(リン酸緩衝生理食塩水) | シグマ | P4417-100タブ | 短期保管用のプレートを準備するために、B04Aプレートの未使用レーンのインレットウェルを補充するために使用されます。 |
| 0.22 μmシリンジフィルター | サトリウス・ステディム | 16532-K | 使用済みMYM-TEの調製 |
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