Streptomyces venezuelaeライフサイクルの蛍光タイムラプスイメージング

要約

出典: Schlimpert, S. et al. マイクロ流体デバイスを使用した完全な S. venezuelae ライフサイクルの蛍光タイムラプス イメージング。J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、細菌の完全なライフサイクルの蛍光タイムラプスイメージングをデモンストレーションします Streptomyces venezuelae マイクロ流体デバイスを使用して、発芽、菌糸の成長、および胞子形成をリアルタイムで視覚化します。

プロトコル

1. 顕微鏡とタイムラプスプロトコルのセットアップ

手記： この方法は、sCMOSカメラ、メタルハライドランプ、ハードウェアオートフォーカス、96ウェルプレート用のステージホルダー、および環境チャンバーを備えた完全電動自動倒立広視野顕微鏡で実装されました。

1. 実験開始後のオートフォーカスの問題を防ぐために、事前に環境チャンバーを30°Cに予熱してください。必要な時間は、使用する環境チャンバー、顕微鏡、加熱システムによって異なります。実験の前夜にシステムを加熱し始めます。
2. 顕微鏡と顕微鏡自動化および制御ソフトウェアの電源を入れます。最適な信号収集と空間分解能を得るには、100倍、1.46 NAのオイルDIC対物レンズなど、高開口数(NA)の油浸対物レンズを使用します。適切なフィルターとダイクロマティックミラーを選択して、微分干渉コントラスト(DIC)画像と黄色蛍光および赤色蛍光タンパク質融合の画像を取得します。
3. 対物レンズに浸漬油を一滴垂らし、マイクロ流体プレートのイメージングウィンドウの底に浸漬液を加えて、画像取得中のセルフォーカスを改善します。密閉されたマイクロ流体デバイスを倒立顕微鏡のステージに慎重に取り付けます。プレートがステージホルダーにしっかりと配置され、実験中にずれないようにしてください。
4. マイクロ流体培養チャンバーのイメージングウィンドウに焦点を合わせ、向きに埋め込まれた位置マーカーを使用します。トラップの高さ0.7μmに対応するトラップサイズ5で、最初のフローチャンバーの左端の部分(「A」とラベル付け)に焦点を合わせます。
5. マイクロ流体ソフトウェアで、入口ウェル 8 から 4 psi で 15 秒間セルをロードします。培養チャンバー内の細胞密度は、ステージをイメージングウィンドウ上で動かして確認します。胞子が捕捉されなかった場合は、細胞ローディングステップを繰り返すか、所望の細胞密度(2,048 x 2,048ピクセルのイメージングウィンドウあたり1〜10個の胞子)に達するまで、ローディング圧力および/または時間を増やします。培養室に過負荷をかけないようにしてください。手記： 通常、 ストレプトミセスのイメージングにはトラップサイズ5を使用しますが、トラップサイズ4と3でも良好な結果が得られています。
6. 制御ソフトウェアでフロープログラムを開始し、画像取得を開始する前に、マイクロ流体プレートを顕微鏡ステージで1時間熱平衡化させます。
7. 顕微鏡制御ソフトウェアで、複数のステージ位置で複数の画像を時間の経過とともに撮影する多次元取得を設定します。
   1. 自動保存の場合:画像ファイルを自動保存するディレクトリを指定します。
   2. [イルミネーション設定]では、特定の構成ごとに最適なイルミネーション設定を事前に決定します。概説した実験では、次の露光時間を使用します:DIC 150ミリ秒、YFP 250ミリ秒、RFP 100ミリ秒。
   3. 時系列の場合:目的の時点で画像を順番に取得するように時系列を設定します。 S. venezuelaeのライフサイクルをイメージングするには、24時間で40分の時間間隔を選択します。
   4. ステージ位置とオートフォーカスの場合:ステージを移動して培養チャンバーをスキャンし、関心のある各イメージング位置のステージ位置を保存します。単段位置が十分に離れて配置され、光退色と光毒性を最小限に抑えるようにしてください。通常、最大 12 個のポジションを使用します。各時点でオートフォーカスルーチンを実行して、遅い焦点ドリフトを補正します。顕微鏡制御ソフトウェアで利用可能な場合は、オートフォーカス戦略を「ハードウェアオートフォーカスによるローカルサーフェス更新」に設定します。選択したステージ位置のZ座標が確認されたら、ハードウェアオートフォーカスをアクティブにします。
8. 顕微鏡制御ソフトウェアでタイムラプス実験を開始します。
9. 後ですべてのステージ位置に焦点が合っていることを確認します。数時間にわたるタイムラプス実験では、オートフォーカスを使用してもステージドリフトが見られることがあります。ステージの位置に焦点を合わせ直す必要がある場合は、適切な時点で実験を停止し、焦点を調整して、定義されたイメージング時間間隔内に実験を再開します。
10. 24〜30時間後、または関心領域の菌糸が胞子に分化したら、画像取得を停止します。次に、ソフトウェアでフロープログラムを停止し、マイクロ流体デバイスを分解します。
11. 使用済みのマイクロ流体プレートを短期保存用に準備します。ウェル1から6に残った培地を取り出し、廃棄物ウェル7とセルローディングウェル8を空にします。無菌条件下で、レーン「A」の使用済みウェルと未使用レーン(「B」から「D」)のウェルをプレート上の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再充填します。プレートが乾燥しないようにパラフィルムで密封し、4°Cで保管します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B04A CellAsic 細菌細胞用ONIXプレート	メルク・ミリポア	B04A-03-5PK	マイクロ流体培養プレート
CellAsic ONIX マイクロ流体灌流システムおよび ONIX FG (バージョン 5.0.2)	メルク・ミリポア	EV-262	最新のONIXバージョン(2015年7月)とプログラムの使用方法の説明は、こちらでご覧いただけます:http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 顕微鏡	ツァイス	431007-9902-000	全自動・電動倒立広視野顕微鏡
インキュベーター XL multi S1 温度モジュール S1 と加熱ユニット XL S2 付き	ツァイス	411857-9061-000	顕微鏡を囲む環境チャンバー
Plan-Apochromat 100x/1.46 オイルDIC対物レンズ	ツァイス	420792-9800-000
オクラフラッシュ4 V2	浜松ホトニクス株式会社	C11440-22CU型
イルミネーター HXP 120V	ツァイス	423013-9010-000
FLフィルターセット 46 HE YFP シフトフリー	ツァイス	489046-9901-000	蛍光フィルターセット、励起500/25nm、発光535/30nm
FLフィルターセット63 HE RFPシフトフリー	ツァイス	489063-0000-000	蛍光フィルターセット、励起572/25nm、発光629/30nm
マルチウェルプレート用取り付けフレームK-M	ツァイス	000000-1272-644	マイクロ流体プレート用ステージホルダー
ゼンプロ2012	ツァイス	410135-1002-120	顕微鏡制御ソフトウェア
ZENモジュールタイムラプス	ツァイス	410136-1031-110	タイムラプス顕微鏡実験をセットアップするためのソフトウェアモジュール
ZENモジュールタイル/位置	ツァイス	410136-1025-110	特定のステージ位置を保存するソフトウェアモジュール(xzy)
フィジー	オープンソースソフトウェアパッケージ	http://fiji.sc/Fiji	タイムラプス動画の生成
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)	シグマ	P4417-100タブ	短期保管用のプレートを準備するために、B04Aプレートの未使用レーンのインレットウェルを補充するために使用されます。
SV60	ジョン・イネス・センター株コレクション		divIVA‐mcherryとftsZ‐ypetを発現するベネズエラ菌株