抗生物質ストレス下における 緑膿 菌の群れ行動

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方法論記事

抗生物質ストレス下における緑膿菌の群れ行動

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2025年9月26日

この記事について

要約

出典: Bru、J.、 et al.、 細菌群のタイムラプスイメージングと集団ストレス反応。 J. Vis. 経験。 (2020年)

このビデオは、寒天プレートのセットアップとタイムラプスイメージングを使用して、抗生物質を混合した同じ培養物を含む中央培養物からサテライトスポットへの細菌の増殖を観察することにより、緑膿菌の群れ行動を分析する手順を示しています。

プロトコル

1. 緑膿菌の増殖 とめっき条件

10 gのLB-ミラーパウダーミックスを400 mLのddH₂Oに加えて、400 mLの溶原性ブロス(LB)を調製します。2%LB-寒天ペトリ皿用にさらに8 gの寒天を追加します。オートクレーブで滅菌します。
溶融したLB-寒天培地20 mLを直径10 cmのシャーレに注ぎ、室温で一晩固化させます。液体培地を室温で保存し、寒天プレートを4°Cで保存します。
縞模様 緑膿菌 - 80°Cで保存された冷凍ストックから、滅菌ループまたは木の棒を使用して、LB-寒天ペトリ皿に。ペトリ皿を37°Cで一晩逆さまにインキュベートします。LB寒天プレートを4°Cで最大1週間保存します。
滅菌ループまたは木の棒でペトリ皿から単一のコロニーをピックアップし、それを2 mL LB培地に接種し、100 rpmに設定されたローラードラムで37°Cで一晩(16〜18時間)飽和するまで培養物をインキュベートします。
P20ピペットを使用してステップ1.4から5 μLの一晩培養物をピペットし、スポッティング領域から2.5 cm上の角度(10〜45°)でピペットチップに近づき、最初のストップまでピペッティングし、液滴のみで寒天に触れます(図1B)。
1. 寒天を損傷する可能性があるため、ピペットチップで寒天に触れないでください。テンプレートを使用して、さまざまな群がる寒天プレートにスポットを一貫して配置します。
抗生物質治療の場合は、ステップ1.4の30 μLの一晩培養緑膿菌を6 μLの3 mg/mLゲンタマイシン、10 μLの100 mg/mLカナマイシン、または7.5 μLの100 mg/mLホスホマイシンと混合します。すぐに次のステップに進みます。
1. P20ピペットを用いて抗生物質処理された 緑膿菌 6 μLをピペットし、スポッティング領域から2.5 cm上の角度(10〜45°)でピペットチップに近づけて、皿の中心を中心に半径2.8 cmの同心円上の6つの等距離のサテライト位置にスポットを置き、最初の停止までピペッティングします。液滴のみで寒天に触れます(図1D)。
2. 寒天をピペットチップで触れると、寒天が損傷する可能性があるため、避けてください。一貫性を保つためにメッキテンプレートを使用します。
透明なペトリ皿の蓋を黒い蓋に交換します(図2A)。
スウォーミング寒天プレートを、37°Cに設定したインキュベーター内のスキャナーに置き、10Lのウォーターバスで75%の湿度を維持します(図1E、 図2B)。注意： 群がる寒天プレート上の斑点のある細胞を邪魔しないでください。プレートは常に上を向いてください。

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結果

図1:の概略図 緑膿菌群集アッセイと集団ストレス応答。(A)緑膿菌細胞は、37°CのLBブロスで一晩(約1.5のOD₆₀₀まで16〜18時間)増殖し、(B)群が寒天プレートの中央にスポットがあります。一晩培養物を(C)ファージまたは(D