緑膿菌における抗生物質ストレスに対する群れ回避反応のイメージングと定量化

要約

出典: Bru、J.、 et.al。細菌群のタイムラプスイメージングと集団的ストレス応答 J. Vis. 経験。 (2020年)

このビデオでは、群がる寒天プレートアッセイを使用して、 緑膿菌 の群れ回避行動を視覚化および測定する方法を示します。制御された条件下でのタイムラプスイメージングのセットアップを示し、抗生物質誘発性ストレス信号が細菌の動きをどのように方向転換するかを説明し、画像分析によって定量化されます。

プロトコル

1. スキャナによる画像取得

1. フラットベッドドキュメントスキャナーの40〜60 cm上のラックに黒いマットな布を取り付けて、ペトリ皿の周囲の照明を減らします。結束バンドを使用して固定します(図1B)。
2. スキャナーは、スキャン ソフトウェアと自動スクリプト ソフトウェアを使用して制御されます。
   1. スキャンソフトウェアで、[ホームモード]を選択します(図2A)。画像タイプで色を選択して、カラーで画像をキャプチャします。画質を設定するには、[宛先]の[その他]を選択し、[解像度]を300dpiに調整します。[ターゲットサイズ]で[オリジナル]を選択して、画像の標準サイズを維持します。[画像調整]のすべてのオプションは、標準の画質についてはオフのままにします。手記：ターゲットサイズは、デフォルトでオリジナルに設定されています。[ターゲットサイズ]の他のオプションを選択するには、最初に[プレビュー]をクリックします。
3. スキャンの右側にあるフォルダーアイコンをクリックして、画像の保存パスを設定し、ファイルの保存設定を開きます(図2A)。
   1. [場所]の[その他]を選択して、画像を保存するフォルダーを選択し、[参照]をクリックします。画像を保存するフォルダーを選択します。
   2. [プレフィックス] テキスト ボックスに画像に名前を付けます。開始番号 001 を設定して、画像の命名順序を開始します。[画像形式]の[種類]で[JPEG(*.jpg)]を選択し、[オプション]をクリックして[詳細]を調整して、ファイル形式をJPEGに設定します。[圧縮レベル]を[16]、[エンコーディング]を[標準]に調整して、画像形式の品質を設定し、[ICCプロファイルを埋め込む]にチェックを入れます。[OK]をクリックしてウィンドウを閉じます(図2B)。
   3. 最初のオプションはオフのままにし (「同じ名前のファイルを上書きする」)、次の 3 つのオプション (「次のスキャン前にこのダイアログ ボックスを表示する」、「スキャン後に画像フォルダを開く」、「スキャン後にページの追加ダイアログを表示する」) をオンにします。[ OK ] をクリックしてウィンドウを閉じます
   4. 「 プレビュー」をクリックして画質を確認します。プレビューウィンドウが表示され、 スキャン アイコンが機能するようになります(図2C)。
4. スクリプトソフトウェアを使用して、画像取得を自動化します。提供されたスクリプトは、[スキャン]ウィンドウで[スキャン]をクリックし、[ファイル保存設定]ウィンドウで[OK]をクリックします。
   1. [ タスク] | Single_scan.tsk と Idle_scanning.tsk の両方をインポートして選択します。 図 2D を参照してください。メモ: Single_scan.tsk は、[スキャン] ウィンドウの [ スキャン ] ボタンをクリックし、[ファイルの保存設定] ウィンドウで [OK ] をクリックします。 Idle_scanning.tsk は 30 分ごとに Single_scan.tsk をアクティブにします。 Idle_scanning.tskのアクティブ化を変更することで、スキャン頻度を変更できます。
   2. アイドルスキャン(インポート)とシングルスキャン(インポート)の両方を選択し、アイドルスキャン(インポート)を右クリックし、[有効]を左クリックして、30分間隔で自動スキャンを有効にします(図2D)。

手記： 自動スキャンは、ユーザーがスクリプトを手動で停止するまで実行されます。スクリプトを停止するには、[ アイドルスキャン(インポート)]を選択し、[ アイドルスキャン(インポート)]を右クリックして、[ 有効]を左クリックします。チェックマークが外されます。

2. タイムラプス画像のコンパイルと群れ反発力の測定

1. ImageJを使用して動画編集や画像解析を行います。
2. スキャンしたすべての画像をImageJにインポートするには、[ ファイル] |インポート |[画像シーケンス] を選択し、画像を選択します。シーケンス オプション ウィンドウで、 RGBに変換 にチェックを入れて、画像をカラーのままにします。 画像数 は、選択した画像の数を示します。
3. フォルダー内の最初の画像から開始するには [開始画像 ] を 1 に保ち、画像の元のサイズを保持するには [画像を 100% で 拡大縮小] に保ちます。[ 仮想スタックを使用] はオフのままにします。[ OK ]をクリックし、画像が読み込まれるのを待ちます(図3A)。
4. [ 編集] |オプション |入力/出力... を呼び出し、 JPEG品質 を100に調整します。
5. ファイルを.aviとして保存するには、[ ファイル] |名前を付けて保存 |AVI です。圧縮 を JPEGに、 フレームレート を5fpsに調整します(図3B)。.aviタイムラプスを目的のフォルダーに保存します。
6. 群れの反発距離を定量化するには、ImageJで群れ期間の終わり近くの画像を開きます。[ファイル] |画像を開いて 選択します。[ 分析] |[スケール] を設定し 、[ ピクセル単位の距離] を 118 に、 既知の距離を 1、[ ピクセルの縦横比 ] を 1.0、[ 長さの単位] を cm に設定します (図 3C)。[ グローバル ] はオフのままにします。[ OK ] をクリックしてウィンドウを閉じます。
7. ストレートアイコンをクリックし、衛星位置のコロニーの中心から群がる個体群の端まで測定します。[分析] |測定値(長さ)で新しいウィンドウを表示するための測定値(図3D)。手記： 「+」はズームインし、「-」はズームアウトします。

結果

図1:インキュベーター内のスキャナーのセットアップ。 (A)黒いペトリ皿の蓋。これらの蓋は、光の反射を減らし、透明なペトリ皿の蓋を置き換えるためにスキャン中に使用されます。(B)フラットベッドドキュメントスキャナーを37°Cに設定したインキュベーターに入れます。黒い蓋の付いた6枚のプレートをスキャナーの上に置きます(左画像)。スキャナーの60cm上のラックには黒のマットな生地が取り付けられており、反射や迷光をさらに...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
バクト寒天、脱水	BDディフコ	214010	LB-寒天プレートおよび群が寒天プレート用
カサミノ酸	BDディフコ	223050	群がるメディア用
D-グルコース	フィッシャーケミカル	D16500	葡萄糖。群がるメディア用
硫酸マグネシウム七水和物	シグマ・アルドリッチ	230391	群がるメディア用
リン酸カリウム一塩基性	シグマ・アルドリッチ	P0662	5X M8メディア用
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S9888	5X M8メディア用
リン酸二塩基性七水和物	フィッシャーケミカル	S373	5X M8メディア用
株
緑膿菌	シリヤポーンラボ	AFS27E.118	PA14株
調度
ブラックスプレーペイント	クリロン	5592 マットブラック	黒い蓋の場合
8インチ結束バンド	ガードナーベンダー	E173770	黒のマットな生地を貼り付ける場合
シャーレ(100mm×15mm)	漁夫	FB0875712	100 x 15 mmポリスチレンプレート
備品
イメージJ	NIHの	v1.52a	画像解析用ソフトウェア
孵卵器	VWRの	89032-092	37°Cでの細菌の増殖用
スキャナー	エプソン	エプソンパーフェクションV370写真	イメージングプレート用スキャナー
スキャナ自動化ソフトウェア	ロボタスクライト	v7.0.1.932	30分間の内部イメージング用
スキャナ画像取得ソフトウェア	エプソン	v9.9.2.5US	イメージングプレート用ソフトウェア