ビ ブリオパラ溶血性ビブリオ のスウォーマー細胞への分化の誘導

要約

出典: Heering、J.、 et al. Vibrio parahaemolyticus スイマー細胞とスウォーマー細胞の細胞分化と単一細胞イメージングの誘導 J. Vis. 経験。 (2017年)

このビデオは、特別に調製された寒天培地を使用して、ビ ブリオパラ溶血性ビブリオ におけるスウォーマー細胞分化の誘導を示しています。鉄の枯渇、カルシウムの補給、表面接触などの環境の手がかりを操作することにより、細菌は刺激され、スイマーの形態から外側のべん毛を持つ細長い群細胞に移行します。これらの分化した細胞は固体表面全体に広がり、形態学的変化の成功を示す特徴的な群れフレアを形成します。

プロトコル

1. スウォーマー細胞分化の誘導

手記： 次の手順では、 V.パラ溶血性を その群れ細胞のライフサイクルに分化させる方法と、固体表面での増殖を刺激する方法について説明します。

1.スウォーミングプレートを調製するために、4 gの心臓注入(HI)寒天培地を100 mL ddH₂Oに懸濁します。

2. HI寒天溶液を電子レンジで慎重に沸騰させ、粉末が溶けるまでボトルを時々振ってください。オートクレーブを121°Cで20分間。

3.オートクレーブ滅菌後、HI寒天培地を60〜65°Cに冷却します。2,2'-ビピリジルを最終濃度50μM(100%エタノール中50mMのストック溶液)まで添加します。CaCl₂ を最終濃度4 mM(ddH₂O中の4 Mのストック溶液)に添加します。必要に応じて、抗生物質を溶液に添加してプラスミドを維持します。

手記： 誘導性プラスミドの使用を計画している場合は、誘導剤を最終濃度まで添加します。

注意: 2,2'-ビピリジル:急性毒性(経口、経皮、吸入)。この化学物質を取り扱うときは、手袋と安全ゴーグルを使用してください。

4.30〜35 mLの最終HI寒天溶液を丸い150 mmのペトリ皿に注ぎ、寒天を固めます。

5.細胞培養をスポットする直前に、寒天プレートを37°Cで少なくとも10分間(または液体残留物がなくなるまで、しかしそれ以上は消えないまで)蓋を開けて直立させて乾燥させます。
手記： 乾燥時間は使用するインキュベーターに大きく依存し、高度に乾燥したプレートでは 、V.パラ溶血性菌の群がることはありません。(このステップは非常に重要です!プレートは新鮮な状態で使用する必要があり、2〜3時間以上経過してはなりません。古いプレートは乾燥しすぎて群がるのを刺激できません。

6.単一コロニーの端から少量の細胞を5 mLのLuria-Bertani(LB)ブロスに接種します。OD₆₀₀ = 0.8に達するまで37°Cで培養物を振とうしながらインキュベートしますが、通常約2〜3時間かかります。その後、細胞はHI群が寒天プレートにスポットされる準備が整います。

7. HI寒天群れプレートの中心に1 μLの細胞培養物をスポットします(図1A)。

8.スポットを乾かします(図1B)。

9.プレートを透明なプラスチックテープで密封し、しっかりと取り付けられていることを確認します。

手記： シールが完璧であることは非常に重要です。テープを貼るときに気泡や折り目が形成されないようにしてください。

10.プレートを24°Cで一晩インキュベートします。これにより、 V.パラ溶血性ス ウォームコロニー 群れコロニーの周辺から伸びる群れフレアを伴う(図2)。

結果

図1:スウォーマー分化の誘導と顕微鏡イメージング用の細胞の調製。 V. parahaemolyticus スウォーマー細胞を作製するためのワークフローの視覚化と、単一のスウォーマー細胞の顕微鏡分析のための顕微鏡スライドの調製を簡素化しました。(A)HI寒天群れプレートの中心に、OD₆₀₀ = 0.8細胞培養物のV.パラ溶血性1 μLをスポットします。(B)スポットが乾燥し、細胞が寒天表面に付着す...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
メディア コンポーネント
LBミディアム	ロス	X968.3
Difco 寒天培地、造粒	BDの	214510	LB培地によるLB寒天培地の調製用
Difco 心臓注入寒天培地	BDの	244400	HI寒天群盤プレートの調製用
アガロースNEEO、超高品質	ロス	2267.3	顕微鏡用アガロースパッドの調製用
添加 物
2,2'-ビピリジル	シグマ・アルドリッチ	D216305-25G	HI寒天群盤プレートの調製用
塩化カルシウム二水和物	ロス	5239.1	HI寒天群盤プレートの調製用
ハードウェア
ペトリ皿 150 mm x 20 mm、カム付き	ザルシュテット	82.1184.500	HI寒天群盤プレートの調製用
ケルビトロン T (B 6420)	ヘレウス	-	HI寒天群れプレートの乾燥に使用