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方法論記事

植物細胞における細菌感染とエフェクタータンパク質送達のモニタリング

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2025年9月26日

この記事について

要約

出典: Lee、H. ら、 感染中に細菌から送達されるエフェクターを視覚化するための緑色蛍光タンパク質システムの分割。 J. Vis. 経験。 (2018年)

このビデオでは、スプリットスーパーフォルダーグリーン蛍光タンパク質(sfGFP)相補と共焦点顕微鏡を組み合わせて、植物細胞における細菌感染とエフェクタータンパク質の送達をモニタリングする方法を示します。このアプローチにより、宿主細胞のサイトゾルへのエフェクター転座を正確に視覚化できます。

プロトコル

手記： 特に明記されていない限り、すべてのステップは室温で実行されます。

1. 植物材料の準備(4週間)

  1. ニコチアナベンタミアナ植物の準備
    1. 各ポットの土壌 表面に2 つの種子を播種し、トレイをプラスチックのドームで覆い、25°C、湿度60%の成長チャンバーで16/8時間の明暗光周期サイクルで種子を発芽させます。
    2. 2週間後、各鉢の最小の苗を選んで捨てます。ステップ1.1.1で発芽に適用したのと同じ成長条件で植物を育て続けます。2日ごとにトレイごとに1リットルの水を追加します。
      手記： 植物の生育条件は、研究室によって異なる場合があります。したがって、植物を健康な状態で育てるために、定期的な水やりプロトコルに従ってください。
    3. 一週間以内に、植物を新しいトレイに移し、さらに成長するための十分なスペースを配置します。生後4週齢で浸透する準備ができるまで、ステップ1.1.1で説明した条件下で植物を成長させ続けます。
      手記： 植物の成長は、研究室間の成長条件によって異なる場合があります。通常、生後4週間のN .ベンタミアナ 植物には約6枚の葉が生えています。
  2. シ ロイヌナズナ トランスジェニック植物の準備
    1. 材料表を参照し、トランスジェニックシロイヌナズナの種子を注文してください。
    2. ~50〜100個のトランスジェニックシ ロイヌナズナ 種子を1mLの蒸留水に浸し、発芽の開始を同期させるために、4°Cで暗所で3日間保存します。
    3. プラグ植物トレイの土壌表面に~2〜3個の種子を播種し、トレイをプラスチックドームで覆います。種子を23°C、湿度60%で発芽させ、10/14時間の明暗光周期サイクルで発芽させます。
      手記： 種子はホモ接合体でなければなりません。ただし、バッチ内の導入遺伝子の存在を再確認することをお勧めします。この場合、種子を70%エタノールで2分間洗浄し、0.05%Triton X-100を含む50%漂白剤(約2%次亜塩素酸塩)で5分間洗浄して殺菌します。続いて、滅菌二重蒸留水(ddH2O)で5〜6回洗浄します。滅菌後、4°Cで3日間層別化し、25μg/LのハイグロマイシンBを含む植物発芽培地に播種してトランスジェニック植物を選別します。
    4. 1週間後、プラグごとに1つの植物だけを残し、手順1.2.3で使用したのと同じ成長条件で植物を成長させ続けます。
      手記： 生後4週間の植物を Pseudomonas syringae 感染に使用しました。植物を健康に保つために、一日おきに植物に水をやります。

2. シュードモナス培養の準備(~1週間)

  1. シュードモナス形質転換のためのプラスミドの構築
    1. 材料表を参照し、III型分泌システム(T3SS)ベースのエフェクターデリバリーシステムベクターの目的のベクターを注文してください。
    2. 部位特異的組換えクローニングを使用して、目的のエフェクター遺伝子をエフェクターデリバリーベクターに挿入します。
      手記： 完全長エフェクタータンパク質の細胞内局在をモニタリングする場合は、完全長遺伝子をpBK-GW-1-2またはpBG-GW-1-2に入れます。蛍光シグナルを増加させるために、2x sfGFP11(sfGFPの第11 β鎖)を含むpBK-GW-1-4またはpBG-GW-1-4を選択することもできます。シグナルペプチドを欠く部分エフェクターの場合は、pBK-GW-2-2またはpBK-GW-2-4を使用します。
  2. sfGFP11タグに融合したエフェクターを運ぶプラスミドをP .シリンガエ pvに変換します。 トマト (Pst)CUCPB5500標準的なエレクトロポレーションを使用しています。
    手記： 必要に応じて、他の シュードモナス 株を使用できます。sfGFP11タグシステムは、広範囲のベクター用に構築されており、エフェクターの遺伝子発現は、例えば、シュー ドモナスフル オレセン (EthAn)に匹敵するAvrRpm1プロモーターによって調節されています。
  3. 形質転換した細菌細胞を、100 μg/mLのリファンピシンと25 μg/mLのカナマイシンまたは25 μg/mLのゲンタマイシンを含むキングスB寒天プレートの表面に穏やかに広げます。28°Cで2日間インキュベートします。
  4. 使用するベクターに適した抗生物質をKing's B液体培地に1つのコロニーに接種し、200 rpmで振とうしながら28°Cで一晩細胞を増殖させます。
  5. グリセロールストックを作ります。オートクレーブグリセロールを最終濃度50%まで添加し、-80°Cで保存します。

3. N. benthamianaにおけるオルガネラ標的sfGFP1-10OPT(sfGFPの1〜10番目のβ鎖)の一過性発現 (4日間)

  1. アグロバクテリウム培養の調製
    1. オルガネラを標的とするsfGFP1-10OPT プラスミドの目的のベクターを注文します( 材料表を参照)。
    2. プラスミドを Agrobacterium tumefaciens 株GV3101細胞に形質転換します。50 μg/mLのカナマイシンと50 μg/mLのリファンピシンを添加したLuria-Bertani(LB)寒天培地で細胞を28°Cで2日間増殖させます。
    3. LB寒天培地上の単一のコロニーから、50 μg/mLのカナマイシンと50 μg/mLのリファンピシンを添加した5 mLの液体LB培地に細胞を接種します。細胞を28°Cで一晩増殖させ、200rpmで振とうします。
    4. 3,000 x g で10分間遠心分離して細胞を回収します。上清培地を注ぎ、ペレットを新しく作った浸潤バッファー1 mLに再懸濁します。
    5. 吸光度600nm(Abs 600nm)で光学密度(OD)値を取得することにより、 アグロバクテリウム の量を測定します。浸潤バッファーを使用して、細菌のOD600 を0.5に調整します。
      注: 1 mLの懸濁液は、2つのスポットに浸透するのに十分です。
    6. 浸潤する前に、培養物を穏やかなロッカーの上に室温で1〜5時間放置します。
    7. 10 μLの先端で浸透させる葉の中央に穴を開けます。1mLの無針シリンジを使用して、 アグロバクテリウム 懸濁液に浸透します。ステップ3.1.5で調製した懸濁液約500 μLをシリンジを介して葉の近軸側に慎重かつゆっくりと注入します。実験的反復のために、少なくとも3つの異なる植物で浸潤を繰り返します。
      手記： 健康と安全上の理由から、浸透中は目の保護具を着用する必要があります。
    8. 葉に残っている細菌懸濁液を拭き取り、浸潤領域の境界をマークします。
    9. 浸透した植物を、ステップ1.1.1で使用したのと同じ成長条件下で2日間保持します。

4. シュードモナスの接種(4日間)

  1. ステップ2.5のグリセロールストックから形質転換した シュードモナス 株を、適切な抗生物質で28°Cで2日間キングスB寒天培地にストリークします。
    手記：シュードモナスの健康は非常に重要です。コロニーがうまく形成されない場合は、続行する前に、細胞を再度縞模様にするか、キングの液体培地で細胞を増殖させます。
  2. ループフルの シュードモナス 細胞をマンニトールグルタミン酸(MG)液体培地に28°Cで接種し、200rpmで一晩振とうします。
  3. 3,000 x g で10分間遠心分離して細胞を回収します。上清培地を注ぎ、ペレットを10 mM MgCl2に再懸濁し、外径600を0.02(1 x 107 cfu / mL)に調整します N. benthamianaの葉の場合は0.002(1 x 106 cfu / mL)シロイヌナズナの葉。
  4. N. benthamianaの場合、sfGFP1-10OPTコンストラクトを運ぶアグロバクテリウムが2日前に浸透した葉の領域にシュードモナス懸濁液を浸潤させます(ステップ3.1.7を参照)。sfGFP1-10OPTトランスジェニックシロイヌナズナの場合、シュードモナス懸濁液を2つの生後4週間の短い日生葉に浸透させます。
    手記： 実験的複製には少なくとも3つの植物が必要です。

5. 共焦点顕微鏡によるsfGFPシグナルの観察(1日)

  1. シュードモナスを接種した葉から葉の円盤を切り取ります。シュードモナスの浸潤後の特定の時点で、40X/1.2 開口数 (NA) C-アポクロマート水浸対物レンズまたは 63X/0.8 NA C-アポクロマート油浸対物レンズを備えたレーザー スキャン共焦点システムを使用して、単一の植物から2 つの 2 cm 2 葉ディスクを画像化します。傷による死んだ細胞の死を避けるために、浸潤穴から離れた細胞を観察してください。
  2. 488nmアルゴンレーザーの低出力設定で観察を開始します。レーザー出力を上げてsfGFPを検出します。
    手記： 通常、レーザー強度の2〜15%を使用して蛍光信号を検出します。ただし、レーザー出力と検出設定は、ユーザーの顕微鏡システムに基づいて調整する必要があります。ここでは、発光フィルターを520〜550nmに設定しました。死んだ細胞は、488 nmのレーザー励起下で自己蛍光を発することがよくあります。したがって、ネガティブコントロールとして、sfGFP11タグのない同じエフェクターを浸透させ、同じ観察条件下で観察する必要があります。さらに、高いレーザー励起はクロロフィルの自家蛍光を誘発する可能性があります。したがって、クロロフィルの自家蛍光を誘発しないように、対照植物細胞を使用してレーザー強度を調整してください。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
シロイヌナズナトランスジェニック系統  Park, E.、Lee, HY、Woo, J.、Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP 分割蛍光タンパク質フラグメントを使用した III 型分泌によるシュードモナス シリンガエフェクターの時空間モニタリング。植物細胞。29 (7), 1571-1584 (2017)
サイト-sfGFP1-10ABRCのCS69831 
NU-SFGFP1-10ABRCのCS69832 
PT-SFGFP1-10ABRCのCS69833 
MT-SFGFP1-10ABRCのCS69834 
PX-SFGFP1-10ABRCのCS69835 
ER-SFGFP1-10ABRCのCS69836 
GO-SFGFP1-10ABRCのCS69837 
PM-SFGFP1-10ABRCのCS69838 
オルガネラ標的sfGFP1-10OPTプラスミド  Park, E.、Lee, HY、Woo, J.、Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP 分割蛍光タンパク質フラグメントを使用した III 型分泌によるシュードモナス シリンガエフェクターの時空間モニタリング。植物細胞。29 (7), 1571-1584 (2017)
サイト-sfGFP1-10アドジーン97387 
NU-SFGFP1-10アドジーン97388 
PT-SFGFP1-10アドジーン97389 
MT-SFGFP1-10アドジーン97390 
PX-SFGFP1-10アドジーン97391 
ER-SFGFP1-10アドジーン97392 
GO-SFGFP1-10アドジーン97393 
PM-SFGFP1-10アドジーン97394 
ER-sfチェリー1-10アドジーン97403 
ER-SFYf1-10アドジーン97404 
サイト-sfCFP1-10アドジーン97405 
t3SSベースのエフェクターデリバリーシステム用のsfGFP11タグ付きゲートウェイ互換ベクターPark, E.、Lee, HY、Woo, J.、Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP 分割蛍光タンパク質フラグメントを使用した III 型分泌によるシュードモナス シリンガエフェクターの時空間モニタリング。植物細胞。29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2アドジーン98250pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t;カナマイシン耐性(25 ug/ml)
pBK-GW-1-4アドジーン98251pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t;カナマイシン耐性(25 ug/ml)
pBK-GW-2-2アドジーン98252pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t;カナマイシン耐性(25 ug/ml)
pBK-GW-2-4アドジーン98253pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t;カナマイシン耐性(25 ug/ml)
pBG-GW-1-2アドジーン98254pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t;ゲンタマイシン耐性(25 ug / ml)
pBG-GW-1-4アドジーン98255pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t;ゲンタマイシン耐性(25 ug / ml)
pBG-GW-2-2アドジーン98256pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t;ゲンタマイシン耐性(25 ug / ml)
pBG-GW-2-4アドジーン98257pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t;ゲンタマイシン耐性(25 ug / ml)
細菌株   
アグロバクテリウム・トゥメファシエンス GV3101  Csaba KonczとJeff Schell、TL-DNA遺伝子5のプロモーターは、新しいタイプのアグロバクテリウム二元ベクターによって運ばれるキメア遺伝子の組織特異的発現を制御します。モルジェネンジェネット。204,383-396 (1986);ゲンタマイシン(50 ug/ml)およびリファンピシン(50 ug/ml)に耐性があります。
シュードモナス・シリンガエ pv.トマトCUCPB5500  クヴィトコ、BH 他。Pseudomonas syringae pv.トマトDC3000III型分泌エフェクター遺伝子はエフェクター間の機能的重複を明らかにするPLoS病原体。5 (4) (2009).;リファンピシン耐性(100 ug/ml)
メディア コンポーネント   
植物発芽培地  2.165g/L のムラシゲ & スクーグ パウダー、10 g/L のスクロースを水に加えます。pH 5.8に調整し、2.2 g / Lのフィタゲルを追加します。オートカーブ。
ビタミンを含むムラシゲ&スクーグミディウムデュシェファ生化学M02224°Cで保存してください。
蔗糖デュシェファ生化学S0809 
フィタジェルシグマ・アルドリッチP8169 
LBメディア  10 g/L トリプトン、5 g/L 酵母エキス、10 g/L NaCl を水に加えます。固形培地の場合は、15 g / Lのマイクロ寒天培地を追加します。オートクレーブ。溶液を55°Cまで冷まし、必要に応じて抗生物質を加えます。
トリプトンBDバイオサイエンス211705 
酵母エキスBDバイオサイエンス212750 
NaClデュシェファ生化学S0520 
マイクロ寒天デュシェファ生化学M1002 
キングスBメディア  10 g/L プロテアーゼ ペプトン #2、1.5 g/L 無水 K2HPO4、15 g/L 寒天から水へ。オートクレーブ。55°Cに冷却し、滅菌15 ml/Lグリセロール、5 ml/L MgSO4 を培地に加えます。必要に応じて抗生物質を追加します。
プロテオースペプトンBDバイオサイエンス212120 
無水K2HPO4シグマ・アルドリッチ1551128 USP 
グリセロールデュシェファ生化学G1345 
MgSO4シグマ・アルドリッチM7506 
バクト寒天BDバイオサイエンス214010 
マンニトール-グルタミン酸(MG)液体培地  10 g / Lのマンニトール、2 g / LのL-グルタミン酸、0.5 g / LのKH2PO4、0.2 g / LのNaCl、および0.2 g / LのMgSO4 を水に加えます。pH 7に調整する
マンニトールデュシェファ生化学M0803 
L-グルタミン酸デュシェファ生化学G0707 
KH2PO4シグマ・アルドリッチNIST200B 
浸透緩衝液  10 mM MES(2-(N-モルホリノ)-エタンスルホン酸)、10 mM MgCl2、150 μMアセトシリンゴン。pH 5.6;使用前に新しいバッファーを準備してください。
MESのデュシェファ生化学M1503100 mM(pH 5.6)のストックを水に調製します。フィルター滅菌。
MgCl2シグマ・アルドリッチM8266100 mMのストックを水に調製します。オートクレーブ。
アセトシリンゴンシグマ・アルドリッチD134406DMSOで150 mMのストックを調製します。
共焦点顕微鏡装置・材料   
710レーザー走査共焦点システムカールツァイス  
Axio observer Z1倒立顕微鏡カールツァイス  

タグ

GFP Pseudomonas sfGFP Nicotiana benthamiana
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