光パターンヒドロゲル分解を用いた標的細菌コロニー単離

Abstract

出典: Fattahi、N.、 et al. 細菌のスクリーニング,選択及び単離のための光分解性ヒドロゲル界面 J. Vis. 経験。(2021)。

このビデオは、UV光を使用して光分解性ヒドロゲルから細菌コロニーを抽出する方法を示しています。特定のコロニーが選択され、パターン化された光露光が局所的なヒドロゲル分解を開始するように設計されています。光の強度と持続時間を調整した後、UV光が照射され、コロニーが解放されます。次に、コロニーはチューブを通して吸引され、下流分析のためにチューブに移されます。

Protocol

1. 細菌株と培養プロトコル

1. 適切な増殖培地を添加した寒天プレート上の細菌の縞状コロニー。本報告では、枯草菌(株1A1135、Bacillus Genetic Stock Center)をATGN(0.079 M KH₂PO₄(リン酸二水素カリウム)、0.015 M(NH₄)₂SO₄(硫酸アンモニウム)、0.6 mM MgSO₄・7H₂O(硫酸マグネシウム七水和物)、0.06 mM CaCl₂・2H₂O(塩化カルシウム二水和物)、0.0071 mM MnSO₄・H₂O(硫酸マンガン(II)一水和物)、 100 μg/mL アンピシリンを添加した ATGN 寒天プレートに 100 μg/mL スペクチノマイシンおよび大腸菌 (株 25922、ATCC) を添加した 0.125 M FeSO₄・7H₂O (硫酸第一鉄七水和物)、28 mM グルコース、pH: 7 ± 0.2、15 g/L 寒天培地プレート。
   注:これらの材料によるヒドロゲルのカプセル化および放出に関する以前の報告では、 A.tumefaciens C58細胞が使用されました
2. ATGN寒天プレートから目的のコロニーを選択し、一晩の培養を開始します。ここで使用する 大腸菌 および 枯草菌 株の場合、ATGN液体培地中で215rpmで24時間振とうしながら、37°Cで培養します。細胞培養物を-80°Cの50%グリセロールで、将来の使用まで保存します。
3. 無菌接種ループを使用してグリセロールストックから両方の株のコロニーを選択し、ATGN液体培地中で37°Cおよび215rpmで24時間インキュベートします。

2. ヒドロゲル形成に必要な材料の調製

1. 光分解性PEG-o-NB-ジアクリレート(ポリ(エチレングリコール)-オルト-ニトロベンジル-ジアクリレート)合成
   注:PEG-o-NB-ジアクリレートの社内合成は十分に説明されており、以前に報告されています。あるいは、合成が日常的であるため、化学合成施設から外部委託することもできます。
2. 架橋バッファー
   1. 細菌株用に選択した培地のレシピを取り、2倍の栄養素を含む培地を調製します。リン酸塩、例えばNaH₂PO₄ (リン酸二水素ナトリウム)を培地に添加し、最終濃度100 mMにします。次に、5 M NaOH(水酸化ナトリウム)(水溶液)を使用してpH値を8に調整します。
   2. 緩衝液を滅菌し、さらに使用するまで-20°Cで保存します。
      注:これらの金属はチオールのジスルフィドへの酸化を触媒するため、媒体中に存在する遷移金属は除外してください。
3. PEG-o-NB-ジアクリレート溶液
   1. アリコートPEG-o-NB-ジアクリレート(分子量3,400 Da)粉末の1mgに対して、3.08 μLの超純水を加えて、49 mM濃度のPEG-o-NB-ジアクリレート(98 mMアクリレート濃度)に達します。
   2. 溶液が十分に混合されるまでボルテックスし、さらに使用するまでこの溶液を-20°Cで保存します。
4. 4アームPEG-チオール溶液
   1. 4アームPEG-チオール(分子量10,000 Da)の調製では、粉末1mgあたり4 μLの超純水を加えて、20 mM濃度(チオール濃度80 mM)に達します。
   2. この溶液がよく混合されるまでボルテックスし、さらに使用するまでこの溶液を-20°Cで保存します。

3. パーフルオロアルキル化(非反応性)カバーガラスの調製

1. ポリプロピレン製スライドメーラー内に最大5枚のスライドガラス(25 mm x 75 mm x 1 mm)を置きます。スライドを2%(w / v)の界面活性剤溶液(材料表)で20分間超音波処理します。
2. スライドを超純水で3回すすぎ、スライドを水中で20分間超音波処理します。N₂ (窒素)の流れを使用してスライドを乾燥させます。
3. スライドガラスの両側を、セクション4.1のプロトコルに従って2分間プラズマ洗浄( 材料表を参照)。
4. プラズマ洗浄したスライドをスライドメーラーに戻し、トルエン中のトリクロロ(1H、1H、2H、2H、-パーフルオロオクチル)シランの0.5%(v / v)溶液を容器に充填します。これらのスライドガラスを室温(RT)で3時間機能化させます。
5. スライドが機能化したら、スライドメーラー内でスライドを、最初にトルエン、次にエタノール(各溶媒で3回)ですすぎます。次に、各官能化スライドをN₂の流れで乾燥させます。

4. チオール官能化(塩基)カバーガラスの調製

1. プラズマクリーナーを使用したガラスカバーガラスの洗浄
   1. 18 mm x 18 mmのカバーガラスをペトリ皿に入れます。次に、ペトリ皿をプラズマクリーナーチャンバーに入れ、プラズマクリーナーの電源を入れます。
   2. 真空ポンプをオンにして、圧力計が400 mTorrになるまでチャンバー内の空気をきれいにします。
   3. 計量バルブを開いて、圧力計が一定の圧力(800-1000 mTorr)に達するまでチャンバーに空気を入れます。次に、「Hi」モードでRFを選択し、カバーガラスを3分間露出させます。
   4. 3分後、RFモードと真空ポンプをオフにします。
   5. ペトリ皿をチャンバーから取り出し、カバーガラスを裏返し、チャンバー内のプラズマに戻し、ガラスカバーガラスの反対側を露出させます。
   6. 手順4.1.2〜4.1.4を繰り返して、ガラスカバーガラスの未処理側をプラズマで洗浄します。
   7. プロセスが完了したら、ペトリ皿をチャンバーから取り出し、プラズマクリーナーと真空ポンプの電源を切ります。
2. ピラニア溶液によるカバーガラスの洗浄とヒドロキシル化
   注:標準的なピラニア洗浄プロトコルを使用して、ガラススリップの洗浄とヒドロキシレート化を行うことができます。ピラニア溶液は、H₂O₂ (過酸化水素) と H₂SO₄ (硫酸) の 30:70 (v/v) 混合物です。ガラスカバーガラスを洗浄する別の方法も使用できます。
   注意:ピラニア溶液は、有機溶剤による腐食性と爆発性が強いため、細心の注意を払って取り扱う必要があります。適切な個人用保護具(白衣、耐薬品性エプロン、安全メガネ、フェイスシールド、耐酸性ブチル手袋)の使用など、適切な安全対策と封じ込め対策を実施する必要があります。ピラニア溶液と接触するすべてのガラス製品と作業面は、使用前に清潔で乾燥しており、有機残留物がない必要があります。ピラニア溶液は、部分的に密閉された容器または密閉容器に保管しないでください。
   1. きれいな100 mm x 50 mmのガラス皿を、ヒュームフードの下で攪拌速度を調整できるホットプレート磁気スターラーの上に置き、14 mLのH₂SO₄ を皿に加えます。
   2. テフロンでコーティングされた鉗子を使用して、テフロンでコーティングされた小さな磁気撹拌棒を皿の中にそっと置きます。次に、酸が飛び散らないようにスターラーをゆっくりと回します。
   3. 次に、6 mLのH₂O₂ を皿にそっと加え、溶液をよく混ぜます。
   4. スターラーの電源を切り、鉗子を使用して攪拌バーを皿から取り外します。次に、鉗子を使用してカバーガラスを皿の中にそっと置き、温度を60〜80°Cに設定します。
   5. 30分後、鉗子を使用してカバーガラスをそっと取り除き、脱イオン水(DI)水に2回浸して、残留ピラニア溶液を洗い流します。
   6. 水ですすいだ後、カバーガラスを室温で去离子水に保管します。
   7. ホットプレートの電源を切り、ピラニア溶液を冷まします。
   8. ピラニア溶液を廃棄するには、冷却したピラニア溶液が入った100 mm x 50 mmのガラス皿を、少なくとも1.5 Lの容量の大きな空のガラスビーカーにそっと置きます。次に、1 Lの水を加えて希釈し、重炭酸ナトリウム粉末を加えて中和します。重炭酸ナトリウムは泡立ちや発熱を引き起こすため、非常にゆっくりと添加する必要があることに注意してください。そうしないと、泡立ちにより酸が飛散する可能性があります。重炭酸ナトリウムをさらに添加しても気泡が発生しない場合は、pHペーパーでpHをチェックし、中和されていることを確認してください。溶液が中和されて冷却されたら、シンクに注ぐことができます。
3. カバーガラスのチオール官能基化
   1. 乾燥トルエン中で269 mMの(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン(MPTS)溶液の5%(v / v)溶液を調製します。
   2. 10 mLの溶液を個々の50 mL円錐形遠心分離管に加えます。洗浄したカバーガラスを各チューブに1つ入れ、溶液に浸します。
      注:50 mLチューブあたり1つのカバーガラスを使用して、他の基質に邪魔されることなく基質の両面のチオール化を保証します。
   3. 4時間後、各カバーガラス(カバーガラスごとに4回洗浄)をトルエン、1:1(v / v)エタノール:トルエン混合物、およびエタノールで洗浄します。
      注:これは、各カバーガラスを、前述の溶液を含む円錐形の遠心分離管に順次浸すことによって行われます。
   4. 基材をすすぎた後、エタノールに浸し、さらに使用するまで4°Cで保存します。
      注:カバーガラスの数によっては、カバーガラスを一度に1つずつ処理するため、この方法は面倒になる場合があります。複数のカバーガラスには、複数のカバーガラスを同時に収めるコロンビアジャーを使用できます。

5. シリコンマイクロウェルアレイの作製

1. パリレンコーティング:以前の研究論文で説明した標準プロトコルを使用して、シリコンウェーハをパリレンでコーティングします。
2. 微細加工:Baruaらによって記述されたプロトコルに従って、マイクロウェルアレイを設計および製造します。​

6.ハイドロゲル形成

1. ガラスカバーガラス上のバルクヒドロゲル形成
   1. ヒドロゲル前駆体溶液:12.5 μLの架橋バッファーを0.5 mLの微量遠心チューブに加え、続いて5.6 μLのPEG-o-NB-ジアクリレート溶液を加えます。最後に、6.9 μLの4アームPEG-チオール溶液を混合物に加えます。
      注:4アームPEGチオールを混合物に添加すると、架橋反応が開始されます。したがって、ヒドロゲル前駆体溶液は、混合後すぐに使用する必要があります。
   2. ヒドロゲル前駆体溶液中の細胞カプセル化については、手順6.1.3〜6.1.9に従います。
   3. 細胞カプセル化の場合は、ステップ6.1.1の前に、架橋バッファーに所望の細胞密度を接種します。以前に報告されたように19、架橋バッファー中の7.26×10⁷ CFU / mLの細胞密度は、ヒドロゲル全体にカプセル化された~90細胞/ mm² の密度と相関することが観察されました。
   4. チオール化したベースカバーガラスをきれいなペトリ皿の上に置きます。カバーガラスの反対側の2つの側面に2つのスペーサー( 材料表を参照)を配置します。
      注:カバーガラスのチオール官能基化は、ヒドロゲルをカバーガラス表面に共有結合的に結合させるために必要です。これは、表面のチオール基とヒドロゲル前駆体溶液中に存在するアクリレート基の反応によって行われます。
   5. スペーサーをペトリ皿にテープで留めて、スペーサーをベースカバーガラスに固定します。
   6. 非反応性のパーフルオロアルキル化スライドガラス上で所望の量の前駆体溶液をピペットで移動します。
   7. パーフルオロアルキル化スライドガラスをベースカバーガラスに置きます(図1C)。ヒドロゲルの形成が完了するまで、RTで25分間待ちます。
   8. ゲル化後、ペルフルオロアルキル化スライドガラスをそっと取り除きます。ハイドロゲルはベースカバーガラスに付着したままになります。​
      注:厚さ12.7μmの膜を得るための18 mm x 8 mmのカバーガラスには、~7 μLの前駆体溶液を使用します(図1A、B)。大量の前駆体溶液を使用すると、ベースカバーガラスの下にヒドロゲルが生じる可能性があります。これにより、ベースのカバーガラスがペトリ皿にくっつき、取り外しようとすると破損する可能性があります。また、カバーガラスの下にあるヒドロゲル残留物は、顕微鏡検査に問題があります。非反応性のパーフルオロアルキル化スライドガラスは、急速に除去するとヒドロゲルが損傷する可能性があるため、穏やかに除去する必要があります。
   9. 基質を60 mm x 15 mmのペトリ皿に、指定された培地に入れます。ここでは、枯 草菌 用の100 μg/mLのスペクチノマイシンまたは大 腸菌 用の100 μg/mLのアンピシリンを37°Cで24時間培養したATGN培地を使用しました。

7. 細胞抽出のための材料準備

1. PDMS(ポリジメチルシロキサン)ホルダーの準備
   1. 10個の18 x 18 mmのカバーガラスをテープで貼り付け、このカバーガラスのスタックをペトリ皿の底に接着します。
   2. PDMSホルダーを製作するには、プラスチックカップにPDMS前駆体と硬化剤を10:1の体積比で混合し、真空デシケーターで脱気し、ペトリ皿に注ぎます。
   3. PDMSを80°Cで90分間硬化させます。次に、テープで留められたブロックの周囲を切断してPDMSホルダーを取り外し、顕微鏡検査での取り扱いを容易にするためにPDMSホルダーをスライドガラスの上に置きます。
2. マイクロシリンジとチューブの準備
   1. 20 cmのPTFE(ポリテトラフルオロエチレン)チューブ(内径0.05)を切断し、チューブの一端を100 μLマイクロリットルのシリンジに取り付けます。
      注:抽出の場合は、ピペットチップを介して放出された細胞を引くと、ヒドロゲル表面が損傷し、汚染につながる可能性があるため、ピペットの使用は避けてください。

8. パターン化された照明ツールによるヒドロゲルの分解

1. 顕微鏡の電源を入れます( 材料表を参照)。次に、パターン化されたイルミネーション ツールをオンにします( 材料表を参照)。
2. 365 nm LED光源のアナログおよびデジタル制御モジュールをオンにします。次に、LED光源制御モジュールの電源を入れます。
3. 顕微鏡ソフトウェアとパターン照明ツールのソフトウェアを開きます。ハードウェア構成ウィンドウが開いたら、[ロード] ボタンを選択します。
   注:ここには3つのデバイスがロードされます。(サードパーティ製カメラ、制御モジュール、パターン化された照明ツール)
4. スタートボタンを押します。ライト パターニング ソフトウェア ウィンドウが開きます。最初のオプションである [デバイス コントロール] ウィンドウの左側のサイドバーにあるボタンを選択します。
5. パターン化された照明ツールをキャリブレーションします。
   注:校正は、露光に使用されるのと同じ顕微鏡対物レンズとフィルターを使用して行う必要があります。
   1. 顕微鏡の対物レンズを10倍に設定します。
      注:この倍率により、顕微鏡レンズとサンプル表面の間に十分な作動距離が確保されます。また、画像ウィンドウを通じて検索プロセスをリアルタイムで監視および記録することもできます。
   2. 顕微鏡レンズとフィルターを露光時の設定に設定し、校正ミラーを顕微鏡の下に置きます。
   3. [デバイスコントロール]ウィンドウで、[LEDコントロール]タブを押します。LED #1をオンにし、光の強度を希望の数に設定します。標準的な抽出実験では、これは60%に設定されています。
   4. [デバイスコントロール]ウィンドウで、パターン化されたイルミネーションツールの製品名でタイトルのタブを押します。次に、グリッドを表示ボタンを押します。
      注:グリッドパターンがキャリブレーションミラーに投影されます。
   5. 顕微鏡の焦点とカメラの露出を調整してグリッドの高画質を取得し、必要に応じてカメラを回転させてグリッド線をカメラのウィンドウフレームと平行に合わせます。
   6. パターン化された照明ツールの製品名で表示されたタブの下にある[キャリブレーションウィザード]ボタンを選択し、このウィンドウでソフトウェアが提供する指示に従います。メモ:サードパーティ製のカメラセットアップウィンドウが開きます。
   7. キャリブレーションタイプ選択ウィンドウが開きます。[自動キャリブレーション]を選択し、[次へ]を押します。
   8. Pre-calibration Adjustmentウィンドウが開いたら、ソフトウェアの指示に従ってNextボタンを押します。
   9. マッピング情報ウィンドウが開いたら、このキャリブレーションを目的のフォルダーに保存します。これは、日付、顕微鏡名、対物レンズ、フィルターを入力することによって行われます。
   10. キャリブレーション後、パターン化された照明ツールの製品名が記載されたタブの下にある[作業領域の定義]ボタンを押して、必要に応じてパターン化された照明ツールの作業領域を定義します。
6. パターン準備のためのシーケンス設計セクション。
   1. ソフトウェアウィンドウの左側のサイドバーにあるシーケンスデザインボタンを押します。次に、プロファイルシーケンスエディタボタンを押します。
   2. 「プロファイルシーケンスエディタ」(Profile Sequence Editor) ウィンドウが開いたら、「プロファイルリスト」(Profile List) の下にある「新規プロファイル」(New Profile) オプションを選択します。
      注:これで、パターンエディタウィンドウが開きます。
   3. 必要に応じて、さまざまなパターンの形状とサイズを選択するか、手動でパターンを描画して、光露光用の目的のパターンを準備します。
   4. バルクヒドロゲルの円形および壊れたクロスパターンについては、手順8.6.5〜8.6.6に従ってください。
   5. 円パターンの場合は、コロニー全体を覆うために、標的細菌コロニーの上に直径30μmの円を定義します。図形の塗りつぶしの色を白に選びます。
   6. 壊れた十字パターンの場合は、パターン描画ウィンドウから寸法が 3 μm x 8 μm の長方形の形状を選択します。これらの寸法の4つの長方形をターゲットコロニーの端に配置し、パターンの半分がコロニーとオーバーレイします。
   7. マイクロウェルアレイの円パターンとリングパターンについては、手順8.6.8〜8.6.10に従ってください。
   8. 円パターンの場合は、ウェルの周囲に直径10μmの円を描きます。図形の塗りつぶしの色を白に選びます。
   9. リングパターンの場合は、直径20μmの円を描き、ウェルの上に置き、形状の塗りつぶしの色を白に選択します。
   10. 直径10μmの円のパターンを塗りつぶし、黒の塗りつぶしの色で描き、ウェルの周囲に配置します。
7. パターンを編集し、目的の抽出方法に基づいて形状を変更します。パターン化された照明ツールの作業領域内に目的のパターンが存在することを確認します。
8. サンプルをPDMSホルダーに入れ、サンプルの上に定義された培地をピペットで置いて、サンプルの脱水を防ぎ、放出された細胞にキャリア溶液を提供します。
9. 次に、これをキャリブレーションミラーと交換します。
10. 顕微鏡の焦点を調整して、ハイドロゲル内のコロニーの鮮明な画像を取得します。コロニーを検査して、関心のあるコロニーを特定します。
11. ここでは、カメラビューにサンプル内のコロニーが表示されている間に光のパターンを設計して、細胞抽出のさまざまなパターンをテストします。
12. 定義したパターンを保存します。定義したパターンを保存した後、「セッション制御」セクションを選択します。
13. このセクションでは、パターン化された照明ツールの製品名というタイトルのタブの下に、保存したシーケンスを追加します。
14. シーケンスを追加した後、パターンをシミュレートするオプションを選択し、表示し、希望の露光位置に調整します。
    注:ここでサンプルの位置を調整して、パターンがターゲット領域に正確に投影されるようにすることができます。
15. 次に、LEDコントロールタブで光量を60%に、露光時間を40秒に調整し、露光プロセスを開始します。
16. ヒドロゲルの分解をリアルタイムおよび明視野モードで監視して、細胞の放出を確実にします。
    注:光にさらされている間は、ヒドロゲルの不要な領域が劣化し、相互汚染を引き起こす可能性があるため、サンプルへの動きを避けてください。

9. 細胞検索

1. 365 nmの光露光と細胞放出の後、マイクロリットルのシリンジとマイクロ流体チューブを使用して細胞を収集します(図2)。
   注:細胞の回収は、パターン曝露の直後に行う必要があります。これにより、放出された細胞が照射領域から離れる前に、局所的な細胞回復が可能になります。
2. 顕微鏡を明視野からFITCまたはTRITCフィルターに変更して、サンプルの露出領域を肉眼で視覚化できるようにします。
3. 露出した領域を見つけたら、チューブの端を照射された場所の上に置きます。次に、顕微鏡フィルターを明視野に戻して、細胞回収をリアルタイムで監視します。
4. チューブのもう一方の端に取り付けられた注射器を使用して、放出された細胞を慎重に引き抜きます。200 μLの溶液を取り出し、DNA分析またはプレーティングのために1.5 mLの遠心分離管に溶液を挿入します。

Results

図1:チオール化ガラスカバーガラス上のヒドロゲル形成。 (A)厚さ12.7μmのスペーサーを、反応性チオール基を含むベースカバーガラスの反対側の2つの側面に配置します。(B)ヒドロゲル前駆体溶液を、非反応性のフッ素化スライドガラス上でピペッティングします。(C)非反応性スライドガラスをスペーサー上に置いて、厚さ12.7μmのヒドロゲルを形成します。(D)非反応性スライドガラスを穏やかに取り除き、ヒドロゲルをベースカバーガラスに付着させたままにします。(E)調製したヒドロゲルは、...

Materials