ウロン酸カルバゾールアッセイを用いた細菌アルギン酸の定量

要約

出典: Al Ahmar、R.、 et al。 Pseudomonas aeruginosa の小コロニー変異体の培養とそのアルギン酸の定量 J. Vis. 経験。 (2020年)

このビデオでは、カルバゾールを使用して酸加水分解後のウロン酸を検出 し、緑膿 菌によって生成されるアルギン酸を定量するための比色アッセイを示します。この方法により、研究および臨床研究において、細菌バイオマスに正規化されたアルギン酸塩生産の比較分析が可能になります。

プロトコル

1. ウロン酸カルバゾールアッセイ

1. 試験する目的の菌株の純粋な培養物から単一のコロニーを同定します。滅菌つまようじを使用してコロニーを摘み取り、つまようじを5 mLの シュードモナス 分離ブロス(PIB)を含む培養試験管に入れます。シェーカーインキュベーターで37°Cで24時間成長させます。
   手記： 次の株、PAO581(PAO1mucA25)、PAO581carA、PAO581carB、およびPAO581pyrDを、 PIA(シュードモナス 分離寒天培地)プレートまたは0.1 mMウラシルを添加したPIAプレートで増殖させ、測定用のアルギン酸を回収しました。
2. 予熱したPIAプレートに、150 μLの培養PIBブロス(15 mm x 100 mmプレート用)または450 μLのブロス(15 mm x 150 mmプレート用)を加えます。滅菌セルスプレッダーを使用して、ブロスをプレートの上に広げます。プレートを37°Cで24時間成長させます。
   手記： プレートを片側に傾けて、ピペットを使用してプレートから余分な液体がある場合は吸引します。プロトコルで使用されるPIBプレートとPIAプレートの両方に20 mL / Lのグリセロールが含まれており、細胞はアルギン酸産生を助ける炭素源として使用します。
3. ピペットコントローラーと滅菌50mLピペットを使用して、成長した芝生に0.85%NaCl(塩化ナトリウム)を加え、セルスプレッダーを使用してプレートをこすってサンプルを収集します。新鮮な50 mLピペットを使用してサンプルを50 mLの収集チューブに吸引します。サンプルを高温でボルテックスして混合し、氷の上に置きます。
   手記： 添加される0.85%NaClの量は、プレートのサイズによって異なります。15 mm x 100 mmのプレートには10-30 mLを使用し、15 mm x 150 mmのプレートの場合は20-50 mLを使用します。
4. 使い捨てキュベットにサンプルを1 mL加え、分光光度計を使用してODを読み取ることにより、サンプルの600 nm(OD₆₀₀)での光学密度を測定します。この手順を2回繰り返して、各サンプルのリードを3回取得します。
5. 3 mLの硫酸/ホウ酸塩溶液を培養チューブに加え、氷の上に置きます。採取したサンプル350 μLを試験管内の酸混合物にゆっくりと加え、低温で短時間ボルテックスします。
   1. 10.099 gの水酸化カリウム(KOH)粉末を45 mLの水に加えて、ホウ酸塩ストックを調製します。混合物に24.74 gのホウ酸(H₃BO₃)を加え、容量を100 mLにします。
   2. 1Lのボトルを氷を入れたシンクに入れ、500mLの濃硫酸を入れます。調製したホウ酸ストック15mLをゆっくりと加えます。ボトルを冷まします。
   3. さらに10 mLのホウ酸塩ストックを加え、合計25 mL。ボトルが冷めたら、容量を1Lにします。
      注意： この方法は、高濃度の硫酸の使用に依存しています。安全を確保するために適切な個人用保護具を使用し、サンプルの適切な廃棄プロトコルに従う必要があります。
      手記： ポジティブコントロールの場合、既知の濃度の D-マンヌロン酸および/または既知の細菌アルギン酸サンプルを収穫し、 緑膿菌 のアルギン酸産生株(例えば、PAO581-PAO1mucA25)を通して精製する。ネガティブコントロールの場合は、0.85%NaCl溶液および/またはPAO1ΔalgD (細菌がアルギン酸を完全に生成できなくなる algD 遺伝子のインフレーム欠失)を使用します。各サンプルから複数のチューブを作成して、技術的な繰り返しの数を増やして統計分析に役立てることができます。各サンプルのチューブを3〜5本準備します。
6. エタノール溶液中の0.1%カルバゾール100 μLを酸/サンプル混合物に加えます。チューブにキャップをかぶせ、中程度の設定でボルテックスを5秒間かけます。55°Cの乾浴に30分間入れます。
7. インキュベーション後、チューブを取り出し、強火で短時間ボルテックスし、5分間冷却します。
   手記： 見える色は紫の色合いになります。色は1〜2時間測定のために安定したままです。
8. きれいなキュベットに1 mLの混合物を加え、分光光度計で530 nmでサンプルのODを読み取ることにより、各チューブのOD₅₃₀ を読み取ります。0.85%NaClを含むチューブを分光光度計のブランクとして使用します。
9. 既知の濃度のD-マンヌロン酸(1,024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、および8 μg/mL)の連続希釈液のOD₅₃₀を測定して、標準曲線を調製します。2回繰り返します。これらの読み取り値から線形方程式を抽出します。
   手記： 標準曲線は一度だけ行う必要があります。そこから抽出された線形方程式は、後のテストに使用できます。
   1. 標準曲線を使用して各サンプル中のアルギン酸塩の濃度を計算し、線形方程式からアルギン酸塩濃度をOD₆₀₀ で割って、OD₆₀₀あたりのアルギン酸塩の総量を求めます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Accu Blockデジタルドライバス	ラボネット	NC0205808	フィッシャーサイエンティフィック経由
ベンチトップ ボルテックス - ジーニー 2	科学産業	G560
ホウ酸	リサーチプロダクツインターナショナル株式会社	10043-35-3
キャビネットインキュベーター	VWRの	1540
カルバゾール	シグマ	C-5132
遠心分離管(50ml)	フィッシャーサイエンティフィック	05-539-13	フィッシャーサイエンティフィック経由
培養試験管	フィッシャーサイエンティフィック	14-956-6D	フィッシャーサイエンティフィック経由
キュベットポリスチレン(1.5ml)	フィッシャーサイエンティフィック	14955127	フィッシャーサイエンティフィック経由
ディポーザブル接種ループ	フィッシャーサイエンティフィック	22-363-597
D-マンヌロン酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	SMB00280
グリセロール	フィッシャーサイエンティフィック	BP906-5	分子生物学用
リン酸緩衝生理食塩水粉末(PBS)	シグマ	P3813
シュードモナス分離寒天培地 (PIA)	ディフコ	292710	フィッシャーサイエンティフィック経由
シュードモナス分離ブロス(PIB)	アルファバイオサイエンス	P16-115	フィッシャーサイエンティフィック経由
丸いつまようじ	ダイヤモンド		どのブランドでも
SmartSpec Plus分光光度計	バイオラッド	170-2525	または優先ベンダー
塩化ナトリウム(NaCl)	シグマ	S-5886型
滅菌ペトリ皿 100mm x 15mm	フィッシャーサイエンティフィック	FB0875713	フィッシャーサイエンティフィック経由
硫酸	フィッシャーサイエンティフィック	A298-212	テクニカルグレード
硫酸(2ノーマルストップ溶液)	研究開発システム	ダイ994