抗体ベースの酵素結合免疫吸着アッセイを使用した細菌アルギン酸塩の定量

要約

出典: Al Ahmar、R.、 et al。 Pseudomonas aeruginosa の小コロニー変異体の培養とそのアルギン酸の定量 J. Vis. 経験。 (2020年)

このビデオでは、 緑膿菌が産生する保護的なエキソ多糖類であるアルギン酸を定量するための比色免疫測定法を示します。この手順には、マイクロプレートをサンプルでコーティングし、特異的抗体を塗布し、酵素基質反応を使用して測定可能な色の変化を生成することが含まれます。次に、標準曲線を使用して、サンプルの色の強度に基づいてアルギン酸塩濃度を決定します。

プロトコル

1. アルギン酸定量のためのELISA

1.マイクロピペットを使用して、収集したサンプル50 μLを未処理の96ウェルプレートに加えます。50 μLのコーティングバッファー(炭酸塩/重炭酸塩バッファーpH 9.6)をウェルに加えます。プレートを37°Cで2時間インキュベートします。

手記： ポジティブコントロールの場合、既知の濃度の D-マンヌロン酸および/または既知の安定なアルギン酸産生株(例: PAO581-PAO1mucA25)を使用できます。ネガティブコントロールの場合は、0.85%NaCl溶液および/またはPAO1ΔalgD を使用します( algD 遺伝子のフレーム内欠失により、細菌はアルギン酸塩を完全に産生できなくなります)。各サンプルから複数のウェルを作成して、統計分析に役立つ技術的リピートの数を増やすことができます。各サンプルの3〜5ウェルを調製します。

2.潮吹きボトルを使用して、ウェルを充填して0.05%トゥイーン20(PBS-T)を含む1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でプレートウェルを2回洗浄し、プレートを裏返して排出します。

3.マイクロピペットを使用して、200 μLのブロッキングバッファー(PBS-T中の10%スキムミルク)をウェルに加えます。4°Cで一晩インキュベートします。

手記： プレートをパラフィンフィルムまたはシュリンクラップで包み、冷蔵庫での蒸発を防ぎます。

4.スパートボトルを使用して、ウェルを満たしてプレートウェルをPBS-Tで2回洗浄し、プレートを裏返して排出します。

5.マイクロピペットを使用して、100 μLの希釈一次抗体(マウス抗アルギン酸モノクローナル抗体)をウェルに加え、37°Cで1〜2時間インキュベートします。

手記： 一次抗体(マウス抗アルギン酸モノクローナル抗体)を、抗体希釈液(1x PBS中の1%スキムミルク)に0.5 μg/mL(1 mg/mLストックの1:2,000の希釈)の濃度で提供しました。

6.潮吹きボトルを使用して、ウェルを満たしてプレートウェルをPBS-Tで3回洗浄し、プレートを裏返して排水します。

7.マイクロピペットを使用して、100 μLの希釈二次抗体をウェルに加え、37°Cで1〜2時間インキュベートします。

手記： 使用した二次抗体は、抗体希釈液中で濃度0.25 μg/mL(0.5 mg/mLストックの1:2,000希釈)のピアスヤギ抗マウスポリ西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)抗体であった。

8.潮吹きボトルを使用して、ウェルを満たしてプレートウェルをPBS-Tで3回洗浄し、プレートを裏返して排水します。

9.マイクロピペットを使用して、100 μLのTMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)-ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)溶液(材料表)を加え、室温で暗所で30分間インキュベートします。

手記： 肯定的な反応の色は青の色合いになります。

10.マイクロピペットを使用して、100 μLの停止溶液(2 N硫酸)を加えます。

手記： 停止液を加えると、色が青から黄色に変わります。反応停止後、最大30分間は色が安定します。

11.プレートリーダーを使用して、450 nmでODを読み取ります。

12. 既知の濃度のD-マンヌロン酸(1,024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、および8 μg/mL)の連続希釈液のOD₄₅₀を測定して、標準曲線を作成します。2回繰り返します。これらの読み取り値から、線形方程式を抽出します。

手記： 標準曲線は一度だけ行う必要があります。そこから抽出された線形方程式は、後のテストに使用できます。

1.標準曲線を使用して各サンプル中のアルギン酸塩の濃度を計算し、線形方程式からのアルギン酸塩濃度をOD₆₀₀ で割って、OD₆₀₀あたりのアルギン酸塩の総量を求めます。

材料