嫌気性細菌によるマウス膣コロニー形成のモデル化

要約

出典: Morrill、SR、 et al。 嫌気性増殖細菌によるマウス膣コロニー形成のモデル J. Vis. 経験。 (2022年)

このビデオは、抗生物質耐性嫌気性細菌を使用してマウスの膣コロニー形成をモデル化するためのプロトコルを示しています。上皮感受性を高めるためのホルモン治療から始まり、その後、嫌気性条件下での膣接種と同時接種が続きます。この手順は、細菌のコロニー形成とバイオフィルム形成を評価するための接種後のサンプリングと培養で終了します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 接種物の調製

手記： このセクションには、嫌気性で成長したストレプトマイシン耐性 ガードネレラ 膣JCP8151B-SmRから接種物を調製するための一般的な手順が含まれています。このセクションのすべてのステップは、嫌気性チャンバーで行う必要があります。

1. 準備されたニューヨーク市ブロスIII(NYCIII)、寒天、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む試薬を嫌気性チャンバーに循環させ、使用前に少なくとも24時間平衡化します。
   手記： ここでは、5%の水素ガス混合物で平衡化されたビニル嫌気性チャンバーを使用しました。内部酸素濃度は通常0ppmですが、材料をチャンバーに循環させると、低レベルの過渡的な増加(10〜25ppm)が発生する可能性があります。
2. 膣接種の2日前に、凍結グリセロールストックから ガードネレラ を嫌気性チャンバー内のNYC III寒天プレートにストレートアウトします。ドライアイスで満たされた小さな容器(空のピペットチップボックスなど)を使用して、チャンバー内外の輸送中にグリセロールストックを凍結状態に保ちます。
3. 膣接種の1日前に、プレートから5〜10個の 個々のガードネレラコ ロニーを使用して、10 mLのNYC IIIブロスを接種します。液体培養物を37°Cで16時間一晩増殖させます。接種されていないままの培地の2番目の1 mLアリコートを含め、接種した培養物と一緒にインキュベートして、培地が汚染されていないことを確認します。
4. 以下に説明するように、液体培養から接種物を調製します。接種物の準備は可能な限り嫌気性チャンバーで行います。
   1. 1.5 mLキュベット(1:5希釈)で800 μLの新鮮培地に200 μLの培養物を加えて、培養光学密度(OD)を測定します。分光光度計を使用して、600 nmの波長で希釈培養物の密度(OD)を測定します(ブランクとして新鮮な培地のみを含む別のキュベットを使用します)。ODの読み取り値に5を掛けると、16時間培養の実際のOD₆₀₀ が得られます。
   2. 実験に必要な接種物の量を計算します。たとえば、マウスあたり20 μLの接種物で15匹のマウスに感染させるには、15 x 20 μL = 300 μLの接種物が必要です。必要以上に約25%多くの接種物を調製するので、15匹のマウスに対して、300 μL +(0.25 x 300 μL)= 375 μLの接種物を調製します。
   3. ステップ1.4.1で決定されたOD₆₀₀ を使用して、ステップ1.4.2で計算した体積でOD₆₀₀ = 5.0の接種物を得るために、スピンダウンして再懸濁する必要がある16時間培養物の体積を計算します。たとえば、培養物のOD₆₀₀ が1.5で、必要な接種量が375 μLの場合、スピンダウンする培養物の量は(375 μL x 5)/1.5 = 1250 μLです。
   4. ステップ1.4.3で計算した培養量をピペットで移動します。滅菌微量遠心チューブに入れます。16,000 x g で1〜3分間遠心分離して細菌をペレット化します。
   5. 上清を除去し、ステップ1.4.2で計算した容量でペレットを嫌気性PBSに再懸濁します。接種物は、計算されたOD₆₀₀ の5.0になります。該当する場合は、感染していない対照群のマウスのビヒクルコントロールとして機能するPBSのチューブも準備します。
5. 嫌気性チャンバーから接種チューブを取り出す前に、PBSで1:10〜1:10 x 10⁶ の連続希釈シリーズを調製します。スポットプレート5は、マルチチャンネルピペットを使用して寒天プレート上に各希釈液を複製し、接種物のコロニー形成単位またはCFUを決定します。これが接種前のCFUです。
6. 膣の前洗浄とガードネレラの接種
   1. 嫌気性チャンバー内に膣洗浄/洗浄チューブを準備します。70 μLの滅菌嫌気性PBSを、マウス番号で標識された1.5 mLマイクロ遠心チューブにピペットで移動させます。マウス1本につき1本の洗浄チューブを用意します。チューブをしっかりと閉じ、嫌気性チャンバーから循環させます。
   2. ステップ2.1で調製した個々のチューブから50 μLの嫌気性PBSを使用して、各マウスに膣洗浄を行います。これらの膣洗浄液は接種前の洗浄液であり、下流の測定やアッセイに使用できます。
      1. 2回目のβ-エストラジオール吉草酸注射の投与後、各マウスをケージまたは前足でつかむことができる清潔で硬い表面の上に置きます。尻尾の中央部分をそっと掴み、後肢が少し高くなり、膣口が露出するように持ち上げます。
      2. ピペットとp-200フィルターチップを使用して、適切なマウスに対応する洗浄チューブから50 μLのPBSを抽出します。ピペットチップを膣内腔~2〜3 mmにそっと挿入し、50 μLの容量を3x〜4xでゆっくりと出し入れします。
      3. 収集した洗浄材料(~50 μL)を元と同じ洗浄チューブに戻し、残りの20 μLのPBSがまだ入っている洗浄チューブ内で上下にピペッティングします。粘液が多すぎてチップが詰まった場合は、清潔な p200 チップを使用して残りの材料を集め、同じ洗浄チューブに入れます。
   3. 濃縮細菌懸濁液またはビヒクルコントロール20μLを各マウスの膣内に膣内投与する。そのマウスの膣洗浄の直後に各マウスに接種します(つまり、次のマウスに進む前に、各マウスに対して順番に洗浄と接種を行います)。このプロセスを簡素化するには、2つのp200ピペットを使用し、1つは洗浄用に50 μL、もう1つは接種用に20 μLに設定されています。
      1. 手順 2.2.1 で説明されているようにマウスを拘束します。p-200チップを使用して、20 μLの細菌懸濁液を膣内にピペットで入れます。2つの異なる細菌種/株を使用した同時接種実験では、各細菌懸濁液を10 μL使用し、接種前に2つの菌株を混合しないようにしてください。
         手記： 膣からのこぼれを避けるために、総接種量は 20 μL を超えてはなりません。
      2. 各マウスの後端を10〜20秒間保持し続けて、投与量が膣口ですぐにプールされないようにします。次に、マウスを新しいケージ/レセプタクルに入れるか、すでに接種されているケージメイトと一緒に置きます。
      3. 手順 2.2 を繰り返します。そしてステップ2.3。マウスごとに。マウスをまだ接種していない動物と一緒にケージに戻さないでください。これにより、接種前にマウスがストレプトマイシン耐性菌に誤ってさらされるのを防ぎます。
   4. すべてのマウスに接種した後、接種チューブを嫌気性チャンバーに戻します。手順1.5で説明したように、別の連続希釈液を調製してプレートします。これが接種後のCFUです。接種後プレートと接種前プレートのCFUを比較して、動物の接種中に嫌気性チャンバーの外で接種物の生存率が低下したかどうかを判断します。
   5. ステップ2.2で集めた膣洗浄液をプレートします。選択的寒天培地(この場合は1 mg / mLストレプトマイシン)。プレートを37°Cの嫌気性チャンバーで1〜2日間インキュベートし、成長を調べます。注:成長は、マイクロバイオームの内因性メンバーが選択マーカーに耐性があることを示し、したがって、標的生物のCFU列挙を曖昧にする可能性があります。
7. 実行可能なガードネレラコロニー形成を決定するための膣洗浄液の収集
   1. 膣のコロニー形成を分析するために、選択した時点で膣洗浄液を収集します。手順 2.2 で説明したように収集します。
   2. 収集後すぐに、膣洗浄液を嫌気性チャンバーに循環させます。各洗浄液10 μLを使用して、ステップ1.5で説明したように、選択的寒天に段階的に希釈およびプレーティングを実行します。CFU数は、 ガードネレラ (または関心のある別の嫌気性菌)による膣のコロニー形成の尺度として使用します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
β-エストラジオール 17-吉草酸	シグマ	E1631	マウスのエストロゲン化
1x PBS	漁夫	MT21040CM	膣洗浄、 G. vaginlalis 接種物の準備、組織の採取と均質化
嫌気性チャンバー	内気	7200000	嫌気性細菌の増殖
バクト寒天	漁夫	DF0140074	G. vaginalis、F. nucleatum、 および P. bivia 寒天プレート
グルコース	シグマ	G7528	G. vaginalis増殖のためのNYCIII培地
ヘペス	セルグロ	25-060-CL型	G. vaginalis増殖のためのNYCIII培地
馬の血清	止血剤	SHS500	G. vaginalis増殖のためのNYCIII培地
水素ガス混合物(水素5%、CO₂10%、窒素85%)	マシソン		嫌気性チャンバー用ガス
Milli-Q浄水器	ミリポール	IQ-7000	メディア製造と均質化用
NaCl	シグマ	S3014	G. vaginalis増殖のためのNYCIII培地
窒素ガス	エアガス		嫌気性チャンバー用ガス
P-200フィルターチップ	ISCバイオ	P-1237-200	膣洗浄と細菌接種
胡麻油	漁夫	ICN15662191	マウスのエストロゲン化
分光 光度 計	バイオクロム	80-3000-45	細菌ODの測定₆₀₀
ストレプトマイシン	ギブコ	11860038	寒天培地に添加して選択プレートを作る
酵母エキス	漁夫	DF0127-17-9	G. vaginalis増殖のためのNYCIII培地