マイクロインジェクションを用いたゼブラフィッシュ幼虫の腸管腔への細菌の局所送達

要約

出典:Li、J.他。Clostridioides difficileのゼブラフィッシュ幼虫感染モデルの開発J. Vis. 経験。(2020年)

このビデオは、麻酔をかけたゼブラフィッシュ幼虫の腸管腔への蛍光標識クロス トリジオイデス・ディフィシル のマイクロインジェクションベースの送達を示しています。幼虫の準備、細菌注射、および蛍光顕微鏡に基づく腸内の細菌局在の確認に関連する手順の概要を説明します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ゼブラフィッシュ幼虫への染色クロストリジオイデス・ディフィシルの注射

1. 受精後5日(ここでは5 dpfと呼びます)に、注射の30%ダニオー培地で0.02%〜0.04%トリカイン(トリカイン粉末を二重蒸留水に溶解し、1 M Tris-HCL溶液でpH = 7に調整する)で20〜30匹のゼブラフィッシュ幼虫を麻酔します~10分前に。麻酔をかけた幼虫を新鮮な10 cmのペトリ皿に移し、余分な30%ダニオー培地を取り除きます。
2. 0.8%の低融点アガロースをゼブラフィッシュの幼虫に一滴垂らして覆います。幼虫を横方向の位置にそっと調整します。ペトリ皿を氷の上に30〜60秒間置き、低融点アガロースを固化させます。アガロースを覆うために、0.02%〜0.04%のトリカインを含む30%ダニオー培地を加えます。
3. 注射液を準備します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液中の0.5%フェノールレッド1 μLを色素染色した クロストリジオイデス・ディフィシル 接種物9 μLに加え、注入プロセスを視覚化します。
4. マイクロローダーを使用して、校正されたマイクロインジェクションニードルに注入液をロードします。ロードされた針をマイクロマニピュレーターに取り付け、実体顕微鏡下に配置します。
5. 注入圧力を600〜900 hPaの間で調整します。注入時間を0.1〜0.3秒に設定すると、0.5〜1.0 nLが得られます。マイクロマニピュレーターの針を、埋め込まれた幼虫を向いて~45°の角度にセットします。
6. 針先を消化管の上、泌尿生殖器の毛穴の近くに置きます。アガロースを貫通し、次に針先で筋肉を突き刺し、腸管腔に挿入し、0.5〜1.0 nLの クロストリディオイデスディフィシルを注入します。蛍光顕微鏡を使用して注入された幼虫を監視し、適切に注入された幼虫をピックアップして共焦点イメージングを行います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース低融点(LM)	プロナディサ	8050	アガロースプレートに使用されます
BacLight レッド バクテリアステイン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	B35001	蛍光色素
キャピラリーガラス	ハーバード大学装置	30-0019	注射針
クロストリジオイデス・ディフィシル			R20291、リボタイプ027株、TcdA+/TcdB+/CDT+生産
DMSOの	カール・ロスGmbH	A994
フィジー	オープンソースプラットフォーム		画像処理
マイクロインジェクター	エッペンドルフ	5253000017
ライカSP8共焦点顕微鏡	ライカ
フェノールレッド	シグマ・アルドリッチ	P0290
トリカイン	シグマ・アルドリッチ	E10521