ゼブラフィッシュ幼虫の腸からの クロストリディオイデス・ディフィシル 細菌の単離と培養

要約

出典: Li、J.、 他、 クロストリディオイデスディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発。 J. Vis. 経験。 (2020年)

このビデオは、ゼブラフィッシュの幼虫の腸からの クロストリディオイデス・ディフィシル 菌の単離と培養を示しています。感染した腸を解剖し、均質化し、抗生物質を含む選択的嫌気性培地でインキュベートします。これらの条件は、競合する微生物を抑制し、生細胞の増殖を促進します。

プロトコル

生存可能なクロストリディオイデス・ディフィシルを回収するための幼虫ゼブラフィッシュの腸の解剖

1. 幼虫から消化管を分離して細菌負荷を分析します。ゼブラフィッシュの幼虫を0.4%トリカインで安楽死させることから始めます。
2. ゼブラフィッシュを滅菌1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)で短時間すすぎ、新鮮なアガロースプレートに移します。
3. ゼブラフィッシュの解剖
   1. ゼブラフィッシュの幼虫の背側幹を頭に近いところに針を差し込み、ゼブラフィッシュを固定します。ランセットで鰓の後ろの頭を取り除きます。
   2. 2本目の針を背側体幹の中央に挿入します。3本目の針をゼブラフィッシュの腹部に挿入し、腸を体腔から引き抜きます。
      手記： 無傷の腸を隔離するには細心の注意が必要です。それが難しい場合は、追加のプルを実行して、残りの腸を残りの内臓から分離します。
   3. マイクロインジェクション針を使用して、10〜15個の腸を200 μLの滅菌1x PBSを含む1.5 mLチューブに移します。
   4. 乳棒で腸を均質化して組織を破壊し、均質化を調製します。乳棒がチューブの底に届くようにして、すべての腸を完全に破壊します。
4. 嫌気性チャンバー内のタウロコール酸塩(TCA、C.ディフィシル胞子の発芽物質)の有無にかかわらず、D-シクロセリンとセフォキシチンを含むC.ディフィシル飼育培地でホモジネートをインキュベートします。
5. プレートを37°Cで48時間嫌気的にインキュベートします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	シグマ・アルドリッチ	A2576	超低ゲル化アガロース
アガロース低融点(LM)	プロナディサ	8050	アガロースプレートに使用されます
クロストリジオイデス・ディフィシル			R20291、リボタイプ027株、TcdA+/TcdB+/CDT+生産
横型ニードルプーラー	サッターインストゥルメント株式会社	P-87
マイクロインジェクター	エッペンドルフ	5253000017
タウロコール酸	カール・ロスGmbH	8149
トリカイン	シグマ・アルドリッチ	E10521