このビデオでは、凍結グリセロールストックから低温ストレスを受けた乳酸菌を回収し、嫌気性インキュベーションによって細菌の生存率を回復し、培養拡大のために活性コロニーを単離する方法を示します。
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方法論記事
乳酸菌の復活と増殖
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2025年9月26日
この記事について
要約
プロトコル
1. 乳酸菌(LAB)培養物の活性化と品質管理のためのプロトコル
- 調製したLAB株のグリセロールストック(2mL遠心分離管)を-80°Cの超低温冷凍庫から取り出し、使用前に解凍させないでください。
- 遠心分離管の開口部を70%アルコールで洗浄・消毒し、使用前に優しくボルテックスしてください。
- 遠心分離管から約250 μL(0.25 mL)のストックLAB培養物を新鮮な2 mL MRS(deMan、Rogosa、およびSharpe培地)試験管にピペットで入れます。
- 試験管を穏やかにボルテックスし、パラフィルム化し、42°Cで12〜16時間一晩嫌気的にインキュベートします。
- 約500 μL(0.5 mL)の一晩培養培養物を2 mL MRS試験管から新鮮な7 mL MRS試験管に取り、ボルテックスし、42°Cで12〜16時間嫌気的にインキュベートします。
- 紫外線可視分光光度計で610 nmでの培養物の光学密度(OD)または増殖を測定し、0.7〜0.9の間で許容可能な結果を記録することにより、微生物の増殖を評価します。
- 7 mL MRSチューブからMRSおよびMRCM-PYR(修飾強化クロストリジウム培地-ピルビン酸)寒天プレートに一晩培養物をストリークし、42°Cで72時間嫌気的にインキュベートします。
- 単離されたコロニーを寒天プレートから摘み取り、新鮮な7 mL MRS試験管に移し、穏やかにボルテックスし、42°Cで12〜16時間嫌気性インキュベートします。
- 単離菌株を含む寒天プレートを冷蔵庫で4°Cで1週間保存します。
- 610 nmの縞模様プレートから単離されたLAB培養物の7 mL MRS試験管からOD(0.7〜0.9)を測定して確認し、関連するすべての実験の作業培養物として使用します。
- 1:10の比率を得るには、9 mLのペプトン水(生理学的緩衝液)を使用して、最終的な7 mL MRS試験管から増殖したLAB培養物を10倍に希釈(連続希釈)します。
- 最後に、すべての発酵実験に適した連続希釈液から約250 μL(0.25 mL)を取ります。
- ステップ2.12の菌株(250 μL)を含むブロスを新鮮な7 mL MRSブロスに移し、42°Cで16時間嫌気的にインキュベートすることにより、活性化します。
手記： すべての L.ブルガリカス 株を新たに調製したMRSブロス中で活性化し、42°Cで16時間嫌気的にインキュベートして、0.7〜0.9の間の細菌増殖の光学密度(OD610 nm)に到達しました。細菌の増殖は、610 nmの紫外可視分光光度計で測定されました。一晩培養のpH値は、LAB発酵の有機最終生成物である乳酸の生成の結果として、3.5〜5.3の範囲でした。バイオセーフティフード内の適切な気流循環やブンゼンバーナーの使用中の火傷の回避などの安全手順が遵守され、遵守されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アニリンブルー | サーモサイエンティフィック | R21526 | 25グラム |
| 牛肉エキス | Research Products International(リサーチプロダクツインターナ | 50-197-7509 | 500グラム |
| 酵母エキス | フィッシャーサイエンティフィック | BP1422-500 | 500グラム |
| 塩化カルシウム二水和物 | フィッシャーサイエンティフィック | C79-500 | 500グラム |
| 無水ブドウ糖 | フィッシャーサイエンティフィック | BP350500 | 500グラム |
| D-フルクトース | アクロスオーガニック | AC161355000 | 500グラム |
| Difco寒天粉末 | ディフコ | DF0812-07-1 | 2キロ |
| TPY寒天 | ディフコ | 211921 | 500グラム |
| エッペンドルフ微量遠心チューブ(スナップキャップ微量遠心分離機セーフロック) | フィッシャーサイエンティフィック | 05-402-12 | 2ミリリットル |
| グリセロール | サーモサイエンティフィック | PI17904 | 500ミリットル |
| 赤外線CO₂インキュベーター | フォルマ・サイエンティフィック | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. ブルガリクス | アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. ブルガリクス | ブルガリア | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. ブルガリクス | ブルガリア | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. ブルガリクス | 食品微生物・バイオテクノロジー研究所(NCATSU) | DAWの | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. ブルガリクス | 食品微生物・バイオテクノロジー研究所(NCATSU) | E22 | |
| ラクトバチルス・ロイテリ | Biogai, Raleigh / 食品微生物学・バイオテクノロジー研究所 (NCATSU) | RD2 | |
| L-システイン塩酸塩一水和物 | シグマ・アルドリッチ | C6852-25G | 25グラム |
| マルトース一水和物 | フィッシャーサイエンティフィック | M75-100 | 100グラム |
| MRSブロス | ネオジェン | 50-201-5691 | 5キロ |
| ペプトンNo.3 | ハッハ | 50-199-6719 | 500グラム |
| リン酸二塩基性カリウム(K₂HPO₄) | Research Products International(リサーチプロダクツインターナ | 50-712-761 | 500グラム |
| 酢酸ナトリウム三水和物 | フィッシャーサイエンティフィック | S220-1 | 1キロ |
| 塩化ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | BP358-1 | 1キロ |
| ピルビン酸ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | BP356-100 | 100グラム |
| ゴムで裏打ちされたスクリューキャップ付き試験管 | フィッシャーサイエンティフィック | FB70125150 | 25 x 150ミリメートル |
| トゥイーン80 | フィッシャーサイエンティフィック | T164-500 | 500ミリットル |
| 超低温冷凍庫 | ソーロー | ||
| ウラシル | アクロスオーガニック | AC157301000 | 100グラム |
| 紫外可視分光光度計 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | エボリューション 201 | |
| ボルテックス・ジーニー2 | フィッシャーサイエンティフィック | ||
| 酵母エキス | フィッシャーサイエンティフィック | BP1422-500 | 500グラム |
| エタノール | フィッシャーサイエンティフィック | T08204K7 | 4リットル |
| 塩酸(6N(認証済み)、フィッシャーケミカル) | フィッシャーサイエンティフィック | SA56-500 | 500ミリットル |
